HPLC法测定藏药八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的含量

逯雯洁 林鹏程

摘要[目的]建立藏药八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱含量的测定方法。[方法]采用反相高效液相色谱法测定，色谱柱为依利特Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾溶液（25∶75，V/V）为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为265 nm。[结果]在0.165 6～2.318 4 μg范围内，盐酸小檗碱浓度与峰面积线性关系良好，R=0.999 5，平均回收率为97.30%，RSD为1.57%（n=6）。[结论]该测定方法快速、重现性好，可用于八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱成分的含量测定。

关键词HPLC；八味獐牙菜丸；盐酸小檗碱

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00050-02

作者简介逯雯洁（1985-），女，青海西宁人，药师，硕士，从事中藏药品分析检验工作，Email：kathy_608@163.com。*通讯作者，教授，硕士生导师，博士，从事天然产物有效成分研究工作，Email：qhlpc@126.com。

收稿日期20131202八味獐牙菜丸为藏医传统名方，收载于1995年《卫生部药品标准》藏药标准（标准号为：WS3-BC-0241-95）[1]，由獐牙菜（Swertia）、兔耳草（Short spike Lagotis）、波棱瓜子、角茴香（Root of Erect Hypecoum）、榜嘎、小檗皮、岩参、木香8味藏药材组成，临床上用于治疗胆囊炎及初期黄疸型肝炎。处方中小檗皮为小檗科植物甘肃小檗（Berberis kansuensis Schneid.）的干燥皮，是常用藏药材之一[2]。《晶珠本草》记载，小檗皮“性凉而糙，能敛毒，清黄水，可除毒病及黄水病，止泻，并可除陈旧热病、陈旧黄水病及一切眼病”。说明小檗皮为方中主要功效成分之一，而原部颁标准无含量测定项。为提高小檗皮的质量控制标准，笔者采用高效液相色谱法对八味獐牙菜丸中的小檗皮建立含量测定方法，以期为八味獐牙菜丸的进一步临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。八味獐牙菜丸样品由2家药厂提供，分别是青海金诃藏药药业股份有限公司（批号20090722、20100420）和宁夏多维药业有限公司（批号060601、080304、080911、090310、090311、091212、091209、090312）。

1.1.2 主要仪器。Waters1525型高效液相色谱仪和Waters2489紫外检测器，均购自Waters公司；METTLER AB204-S电子天平和METTLER TOLEDO电子天平，均购自瑞士METTLER公司。

1.1.3 主要试剂。盐酸小檗碱对照品（0713-200911），购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1 色谱条件。色谱柱为依利特Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾溶液（25∶75，V/V）为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为265 nm。

1.2.2 对照品溶液的配制。精密称取8.28 mg盐酸小檗碱对照品，加无水甲醇超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得，盐酸小檗碱对照品溶液浓度为0.331 2 mg/ml。

1.2.3 提取方法的选择。精密称取1.000 g八味獐牙菜丸（批号060601），置具塞锥形瓶中，精密加入25.0 ml盐酸-无水甲醇（1∶100，V/V），称定重量，分别采用回流和超声提取，提取时间为30 min，在“1.2.1” 色谱条件下测定盐酸小檗碱的含量，比较提取结果的优劣。

1.2.4 提取时间的选择。精密称取1.000 g八味獐牙菜丸（批号060601），置具塞锥形瓶中，精密加入25.0 ml盐酸-无水甲醇（1∶100，V/V），超声提取（功率250 W，频率50 kHz）20、30和40 min，在“1.2.1” 色谱条件下测定盐酸小檗碱的含量，比较提取结果的优劣。

1.2.5 阴性对照溶液的配制。按处方比例称取除小檗皮外的其他药材适量，依据八味獐牙菜丸的处方工艺及供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

1.2.6 方法学考察。（1）系统适应性考察。取适量对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，在“1.2.1” 色谱条件下测定盐酸小檗碱的含量，考察系统适应性。（2）线性关系的考察。按上述色谱条件，分别精密吸取0.5、0.7、1.0、3.0、5.0和7.0 μl对照品溶液（0.331 2 mg/ml），在“1.2.1” 色谱条件下进样，以峰面积y为纵坐标，盐酸小檗碱进样量x为横坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。（3）精密度考察。精密吸取3 μl浓度为0.331 2 mg/ml对照品溶液，连续进样5次，测得盐酸小檗碱峰面积，计算RSD。（4）稳定性试验。取供试品溶液（批号060601），按上述色谱条件分别在0、2、4、6和8 h注入液相色谱仪，进样量3 μl，测定盐酸小檗碱峰面积，计算RSD。（5）重现性试验。取样品（批号060601）制备5份供试液，按上述色谱条件下分别测定，进样10 μl，测定峰面积，按盐酸小檗碱峰面积计算RSD。（6）加样回收率试验。精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加无水甲醇溶解配制成0.331 2 mg/ml的溶液，摇匀；精密称取0.400 g已知含量的八味獐牙菜丸样品（批号060601，含量为2.553 mg/g），称取6份，置具塞锥形瓶中；每份中均同时加入盐酸小檗碱对照品溶液（0.331 2 mg/ml）2.0 ml，并精密加入盐酸-无水甲醇（1∶100，V/V）23 ml，制成供试品溶液，并按色谱条件测定盐酸小檗碱的含量，计算平均回收率和RSD。

1.2.7 样品溶液的含量测定。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，按上述色谱条件对10批样品进行含量测定，以外标一点法计算样品中盐酸小檗碱的含量。

2结果与分析

2.1提取方法的选择 测定结果表明，回流提取法和超声提取法的提取结果差别不大，因回流提取繁琐费时，故选择超声提取法。

2.2提取时间的选择 测定结果表明，30和40 min所测得的芒果苷含量接近，且大于20 min所提的含量，故提取时间选择30 min。

2.3方法学考察 （1）系统适应性考察。图1表明，在相同时间上，对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液图谱有对应的吸收峰，阴性无干扰，表明系统适应性良好。（2）线性关系的考察。计算得线性回归方程为y=4 629 102.46x-136 034.70，R=0.999 5。试验结果表明，在0.165 6～2.318 4 μg/ml范围内，盐酸小檗碱浓度与峰面积的线性关系良好。（3）精密度考察。计算得盐酸小檗碱峰面积的RSD=0.13%，表明精密度良好。（4）稳定性试验。计算得盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.14%，表明稳定性良好。（5）重现性试验。计算得盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.14%，表明重现性良好。（6）加样回收率试验。由表1可知，平均回收率为97.30%，RSD为1.57%，表明该测定方法快速、重现性好，可用于八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱成分的含量测定。

2.4样品溶液的含量测定 以外标一点法计算得10批样品中盐酸小檗碱的含量分别为2.66、3.74、2.61、2.73、2.70、2.57、2.63、2.83、2.72和2.55 mg/g，平均含量为2.77 mg/g。

3结论与讨论

由于原标准对成药中小檗皮未进行定量控制，因此增订了用高效液相法测定小檗皮中盐酸小檗碱的含量测定项。含量测定方法优化时，尝试用乙腈-浓度0.1%磷酸溶液，无水甲醇-水-冰醋酸-三乙胺溶液，乙腈-磷酸二氢钾溶液等多种流动相，最后选择乙腈-浓度0.033 mol/L磷酸二氢钾溶液（25∶75，V/V）为流动相，被测组分达到良好地分离度并且有较好的峰形。根据分别测得2个厂家10批样品中盐酸小檗碱含量在2.55～3.74 mg/g，平均含量为2.77 mg/g，查阅文献可知[3-10]，小檗皮中盐酸小檗碱的含量因产地不同而差异较大，故在藏成药生产过程中还需严格控制小檗皮产地来源以确保药品质量。

参考文献

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