透明质酸摇瓶发酵培养基的优化

黄小忠 曹志杰 张雪松 凡军民

摘要[目的]优化透明质酸摇瓶的发酵培养基。[方法]利用Plaekett-Burman设计及响应面分析法（RSM）对透明质酸产生菌摇瓶发酵培养基进行优化，确定影响透明质酸产量的关键因子。[结果]影响透明质酸产量的关键因子为葡萄糖和酵母膏，葡萄糖最佳浓度为55.78 g/L，酵母膏的最佳浓度为23.43 g/L；在此条件下，发酵液透明质酸的平均产量为0.219（OD400nm）。[结论]通过对培养基的优化，透明质酸产量得到提高，试验值与预测值基本一致。

关键词兽疫链球菌；优化；透明质酸；响应面分析

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00015-02

作者简介黄小忠（1981-），男，江苏海安人，讲师，硕士，从事生物工程研究，Email：523855294@qq.com。

收稿日期20131209透明质酸（Hyaluronic acid，简称HA），又名玻尿酸，是一种白色无味的纤维状或者无定形物质，易溶于水。HA的水溶液呈酸性，带一定的负电荷。其分子是由β-D-葡萄糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成的高分子物质，广泛存在于动物组织间质中，也是链球菌、绿脓杆菌等菌株荚膜的主要成分[1]。笔者以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）作为透明质酸产生菌，利用Plaekett-Burman设计及响应面分析法（RSM）对透明质酸摇瓶发酵培养基进行优化，详细考察了培养基中葡萄糖和酵母膏浓度对透明质酸产量的影响，确定其在发酵培养基中的最佳浓度，以期为工业化生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种。兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus），由江苏农林职业技术学院生物工程系实验室保藏。

1.1.2 主要仪器。超净工作台，离心机，摇床，分光光度计，培养箱。

1.1.3 主要试剂。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB试液）为分析纯，市售；无菌水及去离子水，实验室自制。

1.2方法

1.2.1 培养基的制备。①斜面培养基。葡萄糖5.0 g/L， 蛋白胨10.5 g/L，牛肉膏5.5 g/L，酵母膏7.14 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，琼脂2%，pH值7.0，121 ℃灭菌25 min[2]。②种子培养基。以斜面培养基为基础不添加琼脂。③发酵培养基。蛋白胨10.5 g/L，牛肉膏5.5 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，pH值7.0，121 ℃灭菌25 min。葡萄糖及酵母膏取优化后浓度。

1.2.2 培养方法。①菌种活化。取斜面保藏的原始菌种，接种于新鲜斜面培养基上，于37 ℃培养24 h。②种子培养。取5 ml无菌水冲洗斜面，经离心机4 500 r/min离心10 min，去上清液；用无菌水洗涤沉淀2次，重新悬浮于5 ml无菌水中，摇匀后倒入盛有45 ml无菌水的100 ml三角瓶中，振荡10 min；分别取45 ml液体培养基于250 ml三角摇瓶，加上述菌悬液5 ml，起始pH值7.0，转速250 r/min ，37 ℃下培养18 h。③发酵培养。取种子液，接种量10%，摇瓶装液量20%，转速250 r/min，37 ℃下培养24 h[3]。

1.2.3 测定方法。取样，每瓶抽取不少于6 ml的发酵液，于5 000 r/min离心5 min，去除培养液中的菌体，小心准确量取5 ml清液，再加入适量的无水乙醇，在4 ℃下沉淀1 h，再次以5 000 r/min离心5 min，去上清液，取沉淀，准确加入10 ml去离子水溶解沉淀，加入CTAB试液，以接种的培养液经相同处理后为空白对照，使用分光光度计在400 nm波长下测定吸光度，通过OD值来比较HA的含量[4]。

1.2.4 菌体量测定。利用分光光度计，在波长660 nm处测定一定稀释倍数的发酵液的吸光度，通过OD值来评价菌体含量的高低。

1.2.5 Plackett-Burman试验确定关键因素。通过单因子试验，确定各因素的参照范围，制定基础发酵培养基配方[5]，试验因素水平编码见表1，利用6因子2水平Plackett-Burman设计试验选出摇瓶发酵培养基中的关键因子。

1.2.6 Box-Behnken试验设计。以最大产量区进行Box-Behnken设计，因素水平编码见表2。

2结果与分析

2.1Plackett-Burman试验确定关键因素 由表3可知，经过Plackett-Burman试验的显著性分析，葡萄糖、酵母膏为显著影响因子（可信度大于90%，主效应p≤0.1）。因此选取葡萄糖和酵母膏为主要影响因素。

2.2最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验结果中葡萄糖、酵母膏2个主要影响因素浓度的大小，确定最陡爬坡试验的方向和变化步长，同时通过最快的速度靠近最大HA产量的区域。其他因子浓度分别为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L。由表4可知，主要因素浓度处在第8组试验的条件下，HA产量最高。故以试验8的条件作为响应面设计因素水平的中心点。即葡萄糖、酵母膏的浓度分别为55和22 g/L。

2.3响应面法优化HA的发酵培养基 响应曲面法（RSM）广泛应用可以使得产品的开发成本得到大幅的降低，产品生产的工艺得到优化，产品的质量得到提高，尤其对于微生物发酵条件的优化具有其独特有的优势，除了可以考察各个显著影响因素之间交互作用对优化结果的影响，还能考虑发酵条件中的各种重要影响因素[6]。

2.3.1 二次回归模型拟合及方差分析。用SPSS软件对试验结果进行回归分析和方差分析，进行回归拟合可以得到产量Y对编码自变量X1、X2的回归方程：

2.3.2 响应面分析。利用Design-Expert软件，结合回归方程绘制出响应面分析图及等高线图（见图1）。响应面图代表2个独立变量之间的相互作用，由响应面和相应的等高线可以看出，两因素之间的相互作用都比较明显[7]。

为了进一步确定HA最大产量的稳定点，对回归方程进行整理，解方程得模型的极值点为X1=55.78 g/L，X2=23.43 g/L，代入回归方程，解得预测HA产量为0.221（OD400nm）。经过进一步的验证试验，通过3次平行试验，得到发酵液HA平均产量为0.219（OD400nm），与模型的预测值接近，说明该模型能较好地预测实际发酵情况。

3结论

试验结果表明，通过Plackett-Burman设计试验和最陡爬坡试验以及Box-Behnken设计三者相结合是比较适合于发酵培养基优化的试验设计组合，能快速方便的优化培养基成分以及确定发酵工艺的关键因素。Design-Expert是一种能方便的进行Plackett-Burman设计和响应面优化分析的软件，使用该软件进行数据处理得到的结果比较可靠，能满足相关试验对数据处理的要求。