广州地区番茄青枯病菌的系统发育分析及致病力评价

苏慧慧等

摘 要 2012～2013年，于广州地区采集番茄青枯病病样并进行病原分离工作，经分子鉴定后获得9个菌株。通过PCR扩增获得了其中9个菌株的egl基因序列，采用国际新兴的青枯菌演化型分类框架进行系统发育分析，以NCBI数据库中分离自不同寄主的青枯菌菌株egl基因序列为参考序列进行系统发育树构建。结果表明：9个菌株属于青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株的4个序列变种，分别为序列变种13、14、34、44。以高抗青枯病番茄材料‘兴农021和敏感材料‘金冠3号为试材，评价了其中5个菌株的致病力，结果表明3-1和18-6致病力较高。

关键词 青枯病菌；番茄；分子鉴定；致病力分析

中图分类号 S432.4 文献标识码 A

Abstract To provide theoretic guidance to disease-resistant breeding， a new phylotype classification schemes and pathogenicity determination to investigate Ralstonia solanacearum strains of tomato was used. The result of phylotype-specific PCR with 759/760 primers showed that the specific 281 bp fragment of Ralstonia solanacearum strains was amplified from all 9 isolates. The egl gene fragments of the 9 strains were amplified by PCR using the universal primer Endo-F/R with a 750 bp fragment， phylogenetic analysis examined the partial sequence of the egl gene of 9 isolates and 29 reference strains， the result showed that all of the 9 isolates were belonged to phylotype I. Five isolates was used for the pathogenicity tests by the methods of cutting and soaking roots with 108 cfu/mL， 3-1 and 18-6 was the high virulent strains under the highly resistant varieties ‘Xingnong 021 and sensitive varieties ‘Jinguan 3.

Kew words Ralstonia solanacearum；Tomato；Phylotype identification；Pathogenicity determination

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.031

番茄（Solanum Lycopersicum）是世界上重要的经济作物和模式植物之一[1]。由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Simth）侵染引起的青枯病（Bacterial wilt）是严重影响番茄产量的重要细菌性病害[2]，在中国南方番茄产区普遍发生，其中以广东、广西、福建、台湾、海南危害最为严重[3]。青枯菌菌系复杂，且具有广泛的寄主，可侵染54个科的400多种植物[4]，其中番茄、烟草、马铃薯、茄子、花生等受害最为严重[5-7]。

青枯菌群体在不同地区和寄主来源等具有高度的变异性及适应性，且表现出生理分化和菌系多样性[7]。Prior等[8]提出并建立了依次将青枯菌划分为种（Species）、演化型（Phylotype）、序列变种（Sequevar）及克隆（Clone）4个不同水平分类单元的分类框架，根据地理起源密切相关将演化型分为演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型，其中来自亚洲的生化变种3、4和5归为演化Ⅰ型，美洲的生化变种1、2和2T为演化Ⅱ型，来自非洲的生化变种1和2T为演化Ⅲ型，印度尼西亚的生化变种1、2、2T为演化Ⅳ型。序列变种是以内切葡聚糖酶基因（endoglucanase，egl）进行系统发育分析时，一组序列高度保守的菌株集合体。国际上已经鉴定出51个序列变种，目前主要危害中国青枯菌分属演化型Ⅰ和Ⅱ，以及1、12、13、14、15、16、17、18、34、44和48等11个序列变种[4]。该方法可精确反映青枯菌的地理起源及种内遗传多样性。

目前，番茄青枯病的防治主要通过选育高抗品种、农业措施、化学药剂和生物农药等方法[3]，其中生物防治得到了广泛的关注[9-10]。然而，青枯菌的小种多样性以及与寄主、环境之间复杂的互作，使得抗青枯病的育种十分困难[2]。本研究的目的是分离并开展广州地区番茄青枯菌系统发育分析及致病力评价。通过特异引物的PCR扩增和测序，对番茄发病植株的青枯菌进行分离、纯化、鉴定与检测其致病性，为番茄青枯病的防控工作及番茄的抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1 材料

青枯菌病样采集的番茄品种和来源见表1；TTC和NB培养基配方参照徐进等[11]的研究方法，培养基所用药品均购自鼎国生物公司；PCR扩增所用rTaq和dNTP购自Takara；胶回收试剂盒购自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 供试菌株的采集与分离 2012～2013年从广东省农科院大丰基地和钟落潭基地采集266F1、Y18、齐达利、艾美瑞、L35BD、NEW105等9份番茄抗青枯病敏感材料的发病植株地上部10 cm茎段样品，室内切片，对在显微镜下观察有细菌溢脓现象的材料，参照徐进等[11]青枯菌分离纯化方法获得纯化菌株，于4 °C冰箱内斜面保存备用。

1.2.2 供试菌株的分子生物学鉴定 采用简易提取法[12]提取青枯病菌菌株的基因组DNA，以用于实验的模板。

参照Prior等[8]的研究方法，采用青枯菌特异引物759-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC和760-GTCGCC

GTCAGCAATGCGGAATCG鉴定青枯菌。序列变种鉴定引物Endo-F-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC和Endo-R-GCGTTGCCCGGCACGAACACC用于扩增egl基因序列。所用引物由上海英骏生物公司合成。

PCR扩增体系和程序参照潘哲超等[7]的研究方法，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，参照试剂盒说明书进行回收后送生工生物（上海）股份有限公司，用引物Endo-F进行序列测序。

1.2.3 供试菌株的致病力鉴定 参照何自福等[12]的研究方法，选取经测序鉴定的青枯菌18-1、17-2、18-6、3-1、2-6菌株，在TTC 平板上活化培养48 h 后，挑取中间呈浅粉红色、边缘乳白色的菌落于NB液体培养基（蛋白冻10 g，酵母膏5 g，氯化钠10 g，定容至1 000 mL， pH值7.4），30 ℃，200 r/min培育24 h，调节细菌浓度为1.0×108 cfu/mL，采用浸根接种法，将4～5叶期番茄幼苗从育苗盘中拔出，冲洗净根部土壤，在青枯菌菌液中浸泡20 min，然后移栽于装有灭菌土的塑料盆中，每个处理3次重复，每个重复30株。后续水肥按常规管理。接种后每7 d调查1次，统计发病情况。

2 结果与分析

2.1 番茄青枯菌菌株的分离和分子鉴定

2012～2013年从田间番茄发病植株中分离得到9株分离物（表1），各菌株在TTC平板培养48 h后，菌落经划线培养后具有流动性，中央呈粉红色，外缘为乳白色，形状不规则（图1）。

分离自番茄发病植株的9个菌株经青枯菌特异引物759/760均可扩增得到0.3 kb的片段，说明此9个菌株为青枯菌；其中9个菌株经egl引物扩增可得到750 bp的片段，经测序获得egl基因序列并获得NCBI登录号（KJ913687-KJ913695）。

2.2 番茄青枯菌菌株egl基因系统发育分析

在NCBI中检索并下载不同演化型及序列变种的青枯菌菌株egl基因序列（表2），并以此为参考，比对分析待测菌株的测序结果，进行进化树分析，结果见图2。所有待测菌株均属于PhylotypeⅠ型的序列变种，且待测菌株与已知序列变种序列比对为100%，其中菌株2-6与O3，17-2与Zo4，3-1、3-3、3-5与PSS219，18-1、20-3、18-10与JT523，18-6与PSS81聚类在一起；其中NEW105分离的青枯菌分属于序列变种13（18-1、18-10）和14（18-6），即相同品种分离得到不同青枯病菌株，田间番茄青枯病是由多个不同的青枯菌菌株复合侵染造成的。

2.3 番茄青枯菌菌株的致病力评价

以番茄高抗材料兴农021，敏感材料金冠3号为试材，选取分离自不同番茄病样的5个菌株进行致病力评价，结果见图3。感病品种金冠3号接种各测试菌株21 d后发病率超过50%，在抗病品种兴农021接种测试菌株3-1和18-6 28 d后超过20%，接种试验数据表明测试菌株3-1和18-6为高致病力菌株。

3 讨论与结论

传统青枯菌鉴定方法从分离纯化到生化鉴定，一般需1～2周时间完成，酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫荧光抗体染色（IF）、DNA探针、PCR等技术的发展加快了对青枯菌检测的灵敏度和时效性[3]。国内外学者根据青枯菌hrp基因和16S rDNA序列差异设计引物在马铃薯、烟草、番茄、香蕉等作物快速、准确分离鉴定青枯菌方面开展了大量研究工作[5，6-7，12-13]。Opina等[14]研究发现一对青枯菌特异引物759/760，并成为在番茄、辣椒、烟草、马铃薯等[11，15-17]多种作物分离青枯菌菌株的快速特异的检测手段；本研究分离得到的9个青枯菌分离物均具有利用759/760特异引物扩增得到281 bp的条带，说明其均为青枯菌菌株。

青枯菌与寄主的协同进化过程中，演化出明显的生理及致病力分化特征[7]。Prior等[8]在传统分类方法研究的基础上提出种、演化型、序列变种和克隆的演化型分类框架，在序列变种构建系统进化树过程中，菌株的内切葡聚糖酶基因egl或hrpB等核心基因序列同源性大于99%即可认定为同一序列变种[4]。Xu等[18]基于演化型分类框架对国内13个省、17种不同寄主植物上的286个青枯菌株的研究发现中国青枯菌种内具有丰富的遗传多样性，对来自广东广州（序列变种44）、广西（序列变种14）、湖北（序列变种15）和四川（序列变种44）各1份、福建8份（13、14、15、16、17、18、44）共计12份番茄青枯病菌分属6个序列变种。潘哲超等[7]通过对福建及贵州62个烟草青枯菌系统发育研究发现其均属于亚洲分支的4个序列变种（15、17、34、44），其中15和17为优势菌系。本研究对广州大丰和钟落潭地区的番茄青枯病菌株进行系统发育分析结果表明，9个待测菌株均属于演化I型的4个序列变种（13、14、34和44）；其中分离自广州大丰Y18中3个菌株（3-1、3-3、3-5）均与序列变种34的标准菌株台湾番茄青枯病菌株PSS219一致，2-6与广西油橄榄O3序列变种44一致；分离自广州钟落潭的NEW103的18-6与序列变种14的标准菌株台湾番茄青枯病菌株PSS81一致，而18-1、18-10和20-3为留尼旺岛马铃薯JT523序列变种13一致。由于本研究供试菌株较少，且采集地点为广州市，仅能部分印证和补充前人研究结果，青枯病是南方地区番茄生产的主要限制因素，而基于新的演化型分类框架的序列变种与国内其他番茄主产区之间的对应关系需进一步研究。

本研究进一步对4个序列变种的5个菌株进行致病力分析，结果表明，不同菌株致病力差异较大，其中菌株18-6和3-1致病力较强。由于番茄青枯病一般为开花和坐果期发病，造成严重的经济损失，且青枯菌群具有高度的适应性和变异性，因此开展青枯菌的系统发育及序列变种的致病性评价对指导番茄抗青枯病育种进程有重要意义。

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