猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展

马德慧　薛江东　杨鸣霞　姚睿智　商祥军

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome ， PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引起的猪的一种急性热性接触性传染病，该病主要特征是厌食、发热，怀孕母猪中后期发生流产，产死胎，木乃伊胎；幼龄仔猪发生呼吸道症状和大量死亡。该病最早于1987年在美国发现[1]。荷兰学者Wensvoort G等在1990年底首次从人工和自然感染的病猪中分离到该病毒， 并将其命名为Lelvstad virus （LV）。1992年，世界动物卫生组织（Office Inlernalional Des Epizoolies，OIE）在国际专家研讨会上采用了PRRS这一名称[2]。我国于1996年由郭宝清等首次从国内疑似PRRSV感染猪群中分离出PRRSV，从而证实该病在我国的存在[3]。2006年夏季，“猪高热综合征”在我国南方地区首先发生并流行，然后迅速波及全国大部分养猪地区[4]。2007年1月，经过国内许多专家学者的不断研究，最后确定了引起国内“猪高热综合征”的主要病原是PRRSV变异株，并将这种由PRRSV变异株引起的疾病命名为猪高致病性蓝耳病（HP-PRRS）。近几年，PRRSV不断变异，出现了毒力更强的PRRSV变异株，严重危害着养猪业的发展，由于尚无特效的药物疗法，所以疫苗研制就成为热点问题之一。

1 PRRS灭活疫苗

目前我国使用的商品化PRRS灭活疫苗主要由NVDGJ XAI株和CH-la株灭活制成的，临床实践表明灭活疫苗的免疫保护效果良好。周建胜等对来自山东省接种PRRS灭活疫苗的猪场进行PRRSV特异性抗体检测[5]。发现接种过PRRS灭活疫苗的猪场，PRRSV的特异性抗体水平均较高，达到56.4%～87.9%。郭宝清等选用猪繁殖与呼吸综合征CH-1a株，在Marc 145细胞上增殖了较高滴度后制成PRRS油佐剂灭活疫苗，经过免疫效力试验和攻毒试验发现，用该疫苗免疫过的猪，体内抗体在20 d左右达到高峰，并能维持半年左右，说明该疫苗的免疫保持期较长[6]。王星晨等利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）安徽分离株制备了油乳剂灭活疫苗，用该疫苗免疫猪，7 d后便能够产生抗体，14 d后血清抗体水平达到高峰，免疫28 d以后使用强毒进行攻击，保护力可达80%[7]。

尽管灭活疫苗有较好的免疫效果，但存在免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生周期长、对异源株免疫保护效果差等缺点[8]。Nilubol等报道，用PRRS灭活疫苗免疫仔猪后，攻毒不能保护仔猪对PRRSV的感染，病毒感染后病毒血症的持续时间和病毒的滴度与非免疫组无显著差别，但是能增加中和抗体的效价和产生IFN-γ的细胞数[9]。由此看出PRRS灭活疫苗并不能够适应PRRSV具有很强变异性这一特点，所以单独使用PRRS灭活疫苗来预防PRRS的发生和流行是远远不够的[10，11]。

2 PRRS弱毒疫苗

弱毒疫苗是用微生物产生的自然强毒或从自然界筛选的自然弱毒株通过人工致弱而制成的。尽管弱毒疫苗在制作过程中毒力被减弱，但是病原仍可在免疫动物体内进行繁殖，所以弱毒疫苗具有用量小，免疫原性好，免疫期长，成本低等优点。有学者研究发现接种过PRRS弱毒疫苗的仔猪对抗PRRSV感染的能力要强于接种PRRS灭活疫苗的仔猪。刘海珍等研究表明，首次免疫和加强免疫均用高致病性猪蓝耳病灭活疫苗，抗体保护率只有30～40%；而首次免疫用高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗，加强免疫用高致病性猪蓝耳病灭活苗或弱毒疫苗，免疫保护率能达到80%以上[12]。

目前我国国内使用的PRRS弱毒疫苗毒株主要有R98株、CH-1R株、HuN4-F112株、JXA1-R株等。冷雪等用高致病性PRRSV致弱株TJM制备弱毒疫苗，安全性试验表明该疫苗对4～5周龄仔猪安全，攻毒试验表明疫苗接种猪对强毒攻击的保护率达到80%（4/5）以上，保存期试验显示该疫苗易于保存[13]。李惠兰等用JXAI-R株、TJM-F92株、HUN4-F112株3个毒株高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗对猪进行免疫试验[14]。1个月后抗体检测显示合格率均达到100%；3个月后再次进行抗体检测，合格率仍可保持在80%～100%之间，说明这3个毒株疫苗均可以产生较好的免疫效果。徐小艳等对PRRS活疫苗（JXA1-R株）进行了试验，疫苗的安全性试验和普免试验表明该疫苗用于3～4周龄仔猪是安全的，且免疫效果良好[15]。

尽管PRRS弱毒疫苗对PRRSV的感染能起到一定的保护作用，但是，弱毒疫苗在使用过程中同样存在着一些缺点。有报道称PRRSV可以通过母体胎盘感染给胎儿，如果母猪在怀孕期间接种了PRRS弱毒疫苗，那么很有可能产下带有PRRSV的小猪；另外，有些接种过PRRS弱毒疫苗的公猪精液中也可以分离到病毒。Nielsen J等使用从胎儿、死胎及死亡的仔猪中分离到的疫苗源毒人工感染怀孕晚期的母猪，发现人工分离到的疫苗源毒能在猪群当中持续存在，并且引发疾病[16]。由此看来应该谨慎使用PRRS弱毒疫苗。

3 生物技术疫苗

生物技术疫苗是利用生物技术制备的分子水平的疫苗。目前，PRRS生物技术疫苗主要有基因工程亚单位疫苗和活载体疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等。

3.1 基因工程亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗是用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核细胞（如大肠杆菌）或真核细胞（如鸡胚成纤维细胞，CHO细胞），使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗，又称为生物合成亚单位疫苗。这种基因工程亚单位疫苗，只含有产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，不含有免疫所不需要的成分，因此有很多优点。首先，是安全性好，疫苗中不含传染性材料，接种后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情况，如妊娠母猪；其次，这些疫苗减少或消除了常规活疫苗或死疫苗难以避免的致热原、变应原、免疫抑制原和其他有害的反应原。

Jianzhong Hu等用玉米的愈伤组织表达了PRRSV的M蛋白，并将其口服给小鼠，结果表明该病毒蛋白可以引起小鼠的体液免疫应答并且产生了具有病毒中和活性的IgG和IgA抗体；除此之外，在接种动物的脾细胞还检测到PRRSV特异性的

IFN-γ[17]。这些结果表明利用转基因玉米来生产PRRS口服亚单位疫苗是非常有潜力的。钱洪喜等将构建的pPIC9K-NA和pPIC9K-NE重组质粒电转入到酵母宿主细胞GS115中进行蛋白表达试验[18]。SDS-PAGE结果显示，表达出来的两种产物大小均约为15 kD，Dot blot结果表明表达的两种N蛋白可以与各自对应的阳性血清发生反应，这说明N蛋白具有较好的反应原性。Plana等把PRRSV的ORF2-ORF7基因分别插入到杆状病毒表达载体内，结果只有ORF2、ORF3 、ORF5和ORF7在昆虫细胞中表达，将ORF3和ORF5基因的表达产物提取后免疫怀孕母猪，结果显示，ORF3基因的表达产物保护率为68.4%，ORF5基因的的表达产物保护率为50%[19]。

3.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗包括活载体疫苗和基因缺失疫苗二类。

3.2.1 活载体疫苗

活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。该类疫苗免疫动物后向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况很接近，可诱导产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫，所以可以避免重组亚单位疫苗的很多缺点。如果载体中同时插入多个外源基因，就可以达到一针防多病的目的。

仇玉等以鸡痘病毒为载体构建了重组有PRRSV免疫原性基因的重组鸡痘病毒疫苗rFPV-GP5，rFPV-M和rFPV-GP5-M，结果显示，小鼠在接种重组鸡痘病毒两周后体内可产生PRRSV特异性抗体，并且使用rFPV-GP5-M免疫的小白鼠体内中和抗体滴度明显高于用rFPV-M和rFPV-GP5蛋白免疫组；另外，rFPV-GPS-M可以显著促进小鼠T细胞的增殖和IFN-γ的分泌，这说明重组鸡痘病毒rFPV-GP5-M能够引起机体的体液免疫和细胞免疫，并且效果良好，具有成为抗PRRSV新型疫苗的潜力[20]。郑其升等构建了共表达PRRSV NJ-a株GP4， GP5和M蛋白的重组病毒rMVA-GP5/M/GP4[21]。利用该重组病毒rMVA-GP5/M/GP4免疫小鼠3周后，便可以检测出特异性PRRSV中和抗体，8周后检测发现中和抗体效价达到25，并能持续4周；淋巴细胞增殖试验发现，重组病毒可以使免疫小鼠产生特异性细胞增殖反应，该研究说明rMVA-GP5/M/GP4免疫原性较好，可以作为新型PRRS候选疫苗进行进一步研究。许信刚等成功构建了表达PRRSV GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株X4550（pYA3341-ORF5）。将重组菌口服免疫小鼠后可以产生抗GP5蛋白的中和抗体，同时，还发现重组菌株可以调节细胞免疫；除此之外，淋巴细胞增殖试验还发现，该重组菌能够诱发小鼠体内产生较强的细胞免疫应答[22]。

3.2.2 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除构建的活疫苗，该苗安全性好、不易返祖；其免疫接种与强毒感染相似，机体可对病毒的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚强，免疫期长，尤其适于局部接种，诱导产生黏膜免疫，因而是较理想的疫苗。

武华等通过多年研究获得了一种PRRSV基因缺失疫苗毒株TJM-F92，该疫苗安全性好，怀孕的母猪、幼龄的仔猪都能用。注射疫苗3 d后，猪就产生抗体，可迅速有效地抵抗“蓝耳病”的自然感染[23]。能使猪“蓝耳病”的保护率达到80%以上。

3.3 DNA疫苗

DNA疫苗是应用基因工程技术把编码保护性抗原的基因与能在真核细胞中表达的载体DNA重组，这种目的基因与表达载体的重组DNA可直接接种到动物体内，目的基因可在动物体内表达，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。

马德慧等成功构建了基因疫苗表达载体pEGP5-C1和pEM-C1，并进行了小鼠免疫试验，结果表明重组基因疫苗质粒能够诱导小鼠产生特异性中和抗体，并且从二免后的第一周开始检测到特异性淋巴细胞增殖反应[24]。高磊等分别构建了单独表达PRRSV GP5基因以及PRRSV GP5基因和猪IL-18基因共表达的重组核酸疫苗质粒（pEGFP-GP5和pEGFP-IL 18-GP5 ）[25]。试验表明，接种pEGFP-IL18-GP5核酸疫苗的仔猪体内产生抗体的数量，产生IFN-γ的细胞数和特异性T淋巴细胞增殖反应均高于接种pEGFP-GP5组。杜东华等构造了pcDNA-GP5-M-N真核重组质粒，然后用重组质粒pcDNA-GP5-M-N免疫Balb/c小鼠，中和抗体检测结果表明，首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体（1∶4），随后抗体水平快速升高，第8周抗体效价达到最高（1∶32），该试验结果表明构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体[26]。

4 展望

目前我国在PRRS的预防控制上主要采用的还是常规疫苗，但是由于灭活疫苗免疫效果差、免疫反应持续时间短、需要多次接种、对异源株免疫保护效果差以及弱毒疫苗存在散毒和毒力返强等缺点，因此加快新型生物技术疫苗的研究并将其推广到临床应用已迫在眉睫。

生物技术疫苗凭借其使用安全、保护效果好等优势成为当前人们研究的热点，随着学者们对猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的不断深入，人们对其保护性抗原基因已经基本确定，这些研究成果将为开发新型PRRS疫苗提供依据。科研工作者们可以将抗原基因上与免疫反应无关的作用位点剔除或突变，或者同时将几种不同的保护性抗原基因整合到同一重组质粒，这样一个重组质粒便可以同时表达多种保护性抗原，使疫苗的免疫保护水平大大提升。基因缺失疫苗与其他疫苗之间无免疫干扰性，可以和其他疫苗一起使用，并且储存和使用都比较方便，是很有潜力的新型疫苗，值得进行深入研究。除此之外，理想的疫苗佐剂和表达载体也是接下来需要深入研究的。

总之，伴随着科学技术的发展，相信会有越来越多的新型PRRS疫苗将被应用于临床实践。█（编辑：李雨慈）

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