新疆地区奶牛乳房炎病原菌的流行病学调查

苏少虎 李冉

摘 要：对新疆地区奶牛乳房炎（包括隐性乳房炎和临床乳房炎）进行了发病率和致病菌进行了流行病学调查。结果发现新疆地区7个牧场隐性乳房炎发病率在11.3%～28.8%。大部分乳房炎发病为单一细菌感染引起。隐性乳房炎中共分离得到9个不同种属的病原菌，以凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌和无乳链球菌为最常见。临床乳房炎样品中共分离得到11个不同种属的样品，流行度最高的四种病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。在隐性乳房炎和临床乳房炎样品中均分离得到了金黄色葡萄球菌。

关键词：奶牛乳房炎；病原菌；流行病学

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是乳房受到物理、化学、微生物等致病因子刺激所发生的一种红、热、肿、痛的炎性变化[1]。乳房炎是奶牛最常发的疾病之一，同时也是对奶牛场危害最大、导致奶牛业经济损失最严重的疾病之一[2]。奶牛乳房炎最主要的病因是病原微生物感染乳腺组织，目前为止已发现的约150多种致病菌中，常见的有23种，包括球菌、杆菌、支原体、真菌或酵母菌、病毒等[3]。在所有的病原微生物中，细菌感染是最主要的。奶牛乳房炎分为临床乳房炎和隐性乳房炎。临床乳房炎的主要特点是乳汁发生肉眼可见变化，包括颜色发生改变，乳汁中有凝块和絮状沉淀等；或者乳房局部发生红热肿痛变化；或者奶牛本身发生了系统性变化包括食欲降低、发热、精神萎靡等。隐性乳房炎仅表现出乳汁的体细胞数（SCC）升高和细菌培养阳性等。

实际上，弄清病原菌的类型对乳房炎的防控和治疗具有非常重要的指导意义。在此基础上，笔者对新疆地区的7 个地理位置不同的规模化奶牛场乳房炎发病情况进行流行病学调查，旨在揭示引起新疆地区奶牛临床乳房炎和隐性乳房炎发病的主要病原菌分布情况，以期为牧场乳房炎防控与治疗提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

CMT诊断液由北京奶牛中心提供；各种细菌生长培养基及选择性鉴定培养基购自北京陆桥试剂司；生化编码鉴定管GYZ-15e、TH-16S、链球菌属生化编码鉴定系统和鉴定相关配套试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组提取试剂盒、PCR 反应聚合酶、DNA 分子Marker、琼脂糖、PCR 胶回收试剂盒，均购自北京全式金生物公司。

1.2 采样牛场

选择新疆地区7个规模化奶牛养殖场，每个奶牛场随机无菌收集乳区奶样份80份，共560份冰盒中运送至实验室进行细菌培养。根据牛场的发病情况，在抗生素治疗前无菌收集临床乳房炎样品共81份，放在牛场冰箱中冷冻或冷藏，统一运送至实验室进行细菌培养。

1.3 乳样的采集及隐性乳房炎的检测

清洗乳房后用纸巾擦干，弃掉前3把奶，用0.5%碘伏溶液进行乳头药浴30 s，再用无菌棉球将乳头孔擦干并用75%酒精反复擦拭乳头孔，风干后接取10～15 mL乳样于无菌乳样瓶中，整个采样过程中严禁污染。返回实验室后于每管中取2 mL乳样置于诊断托盘上，在每个托盘中加入2 mL CMT隐性乳房炎诊断液，摇匀，30 s后观察结果。隐性乳房炎根据反应现象和CMT隐性乳房炎诊断液判定标准（见表1）进行判断，阳性以上（SCC>50万/mL）判定为隐性乳房炎样品。

1.4 乳房炎病原菌的分离和纯化

吸取100 μL乳房炎奶汁，用接种环划线接种于5%羊血TSA 培养基上，37℃温箱培养24 h。在平板上判断是否存在污染，如未污染，挑取单菌落再次划线接种于5%羊血TSA培养基上，进行纯化培养，观察菌落大小、颜色、形状及溶血状况等。挑取纯化培养的细菌单菌落进行革兰染色，分为阳性杆菌、阴性杆菌、阳性球菌和阴性球菌。阳性球菌进行触酶试验，阳性者进行凝固酶试验并接种至7.5%氯化钠甘露醇培养基。阴性杆菌接种于麦康凯培养基和SS培养基上，阳性杆菌和阴性球菌视情况进行细菌的测序鉴定。

1.5 乳房炎病原菌的鉴定

1.5.1 生化鉴定

触酶阳性且在7.5%氯化钠甘露醇培养基生长的细菌用葡萄球菌编码系统鉴定；将触酶试验阴性的细菌接种至链球菌生化编码鉴定系统。取在麦康凯培养基上生长并变色的革兰阴性杆菌接种至肠杆菌科生化编码鉴定系统，培养24 h 后观察结果，根据各种鉴定管的颜色变化进行编码鉴定。

1.5.2 16S rRNA基因测序鉴定

对于生长性状较复杂和革兰染色结果较特殊、不能通过生化鉴定方法鉴别的菌株进行测序鉴定。具体操作方法如下：将单个菌株接种于增菌肉汤中，37℃振荡过夜培养； 离心，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，用Premier软件设计16Sr RNA基因的通用引物rDNA-1（5'-GAGATTGATCTGGACCAG-3'）和rDNA-2（5'- TAGCTGGTTACGACAT-3'），经过Blast比对，确定其通用性。设定并摸索合适的PCR反应体系以得到清晰的单一条带用1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如果在1 500 bp 处有清晰条带，且无特异性条带，可以进行PCR 产物的纯化测序。测序结果通过Blast数据库比对，对细菌种属进行精确判定。

2 结果

2.1 隐性乳房炎发病率

由表2看出，新疆地区牛场中隐性乳房炎的发病率在11.3%～28.8%之间，各牛场的隐性乳房炎发病率差异明显，平均发病率为21.4%。

2.2 细菌培养情况

120份隐性乳房炎样品接种到平板上，有102份呈现阳性生长，细菌培养阳性率为85%。其中有91份样品为单一细菌生长，8份样品有两种细菌生长；3份样品有三种及以上细菌生长，污染率为3%。81份临床乳房炎样品中，有65份呈现阳性生长，细菌阳性培养率为80%；其中53份样品为单一细菌生长，6份样品为两种细菌生长；6份样品为三种及以上细菌生长，污染率为7%。

2.3 细菌测序鉴定结果

由图1可见，不同种属的病原菌均可通过16S rRNA基因的序列测定，扩增出约1 600 bp的片段。

2.4 乳房炎病原菌种类

经过生化鉴定和测序鉴定相结合的方法，共分离鉴定得到隐性乳房炎病原菌107株，分为9个不同种属（图2），其中最多的三种隐性乳房炎病原菌依次为凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌和无乳链球菌。临床乳房炎病原菌65株，分为11个不同种属（图3），其中最多的四种病原菌依次为凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。

3 讨论

3.1 乳房炎发病率

试验结果表明，新疆地区的隐性乳房炎发病率为21.4%，各牛场之间的发病率存在较大的差异，这是由于卫生状况和管理措施存在差异造成的。单志贵、萧乾庆、杨章平和双金等报道的隐性乳房炎乳区发病率分别为59.1%、31.9%、28.0%和32.28%[3-6]，均高于本调查显示的结果，说明可能随着环境卫生、挤奶操作的提升，在我国隐性乳房炎的发病率存在着一定程度的降低。实际上，正确的挤奶操作流程，良好的挤奶设备维护和优质的卧床垫料管理，对降低乳房炎的发病率至关重要。乳房炎的样品中大部分细菌培养为阳性，但是也有少部分未培养出细菌，分析原因有以下几点：引起乳房炎的病原微生物不能通过普通培养基培养出来，比如支原体和部分真菌；细菌量太低导致使用普通微生物培养法难以保证高灵敏度；部分由金葡菌感染的病例，细菌可能进入到中性粒细胞内导致无法检测出；临床乳房炎是由革兰氏阴性杆菌引起，病例发现较晚，在检测时细菌已经被乳房内的炎症细胞杀灭。因此，尽管病原微生物培养有时为阴性，但这类乳房炎病例仍然不能被忽视。同时调查结果发现，大部分乳房炎样品中分离得到了单一类型的病原菌，说明无论是隐性乳房炎还是临床乳房炎，其发病主要是由单一种属细菌感染引起的，同时也说明本试验的无菌采样工作较好，出现乳样污染的情况较少。

3.2 乳房炎病原菌流行情况

通过本次流行病学调查可知，在新疆地区引起隐性乳房炎最主要的致病菌为凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌和无乳链球菌；引起临床乳房炎的病原菌主要为凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌和大肠杆菌。中国农业科学院中兽医研究所在上世纪80年代对西北、华北、东北、华南地区22个城市32个奶牛场的一万余头成年泌乳牛进行了临床型乳房炎病因及发病情况调查[7]，我们的最主要病原菌分离结果与其具有一定的差异，说明我国乳房炎的菌群结构发生了较大的变化。

3.3 主要病原菌流行原因分析

凝固酶阴性葡萄球菌是一种条件致病菌，尽管在我国的乳房炎防治中还未引起相应的关注，但外国乳房炎研究者对其引起的乳房炎进行了细致、系统的报道[8-10]，并表明由这类病原菌引起的乳房炎发病正处于上升趋势；我们的调查结果呼应了这方面报道：应该对凝固酶阴性葡萄球菌性乳房炎进行详细地研究，并在临床防治上给予高度的重视。无乳链球菌主要寄存于患病的乳腺组织中，通过不规范的挤奶操作和管理不当在牛群中进行传播。引起的乳房炎具有高传染性。在本部分研究中，无乳链球菌引起乳房炎的比例也较高，提醒我们目前在国内的牛场中，广泛存在着挤奶操作不规范、管理混乱等问题，这些都是需要研究者结合临床兽医及管理者，共同面对、解决的。大肠杆菌作为一种环境性致病菌，与牛场的环境卫生关系最大，同时大肠杆菌性乳房炎可能因为其内毒素的释放引起全身性的败血症，应该引起临床兽医的重视，在治疗时采用非甾体抗炎药结合抗生素的治疗方式，可提高治疗效果。■（编辑：狄慧）

参考文献：

[1] Zhao X and Lacasse P. Mammary tissue damage during bovine mastitis： causes and control[J]. Anim Sci， 2008. 86： 57-65.

[2] 韩博（主译）.牛病学.北京：中国农业大学出版社.2006.

[3] 单志贵.奶牛隐性乳房炎的综合监控技术[J].中国奶牛，1996，（9）：39-40.

[4] 萧乾庆，冯端明，王榕，等. 奶牛隐性乳房炎诊治试验[J].中国奶牛， 1997，（7）：17-18.

[5] 杨章平，王健，丁焕峰，等.奶牛隐性乳房炎的发生规律的研究[J].中国奶牛， 1998，（1）： 18-21.

[6] 双金，嘎尔迪，包鹏云，等.奶牛隐性乳房炎的发生规律及其致病菌的分离鉴定与药物敏感性试验[J].内蒙古农业大学学报， 2001.22（1）： 18-22.

[7] 潘虎，刘纯传，张礼华，等.我国部分地区奶牛乳房炎的病因及发病情况调查[J].中国兽医科技， 1996. 26（2）： 16-17.

[8] Pyorala S and Taponen S. Coagulase-negative staphylococci-emerging mastitis pathogens[J]. Vet Microbiol， 2009. 134： 3-8.

[9] Taponen S and Pyorala S. Coagulase-negative staphylococci as cause of bovine mastitis- not so different from Staphylococcus aureus？ [J].Vet Microbiol， 2009. 134： 29-36.

[10] Schukken YH， Gonzalez RN， Tikofsky LL， et al. CNS mastitis： nothing to worry about？ [J].Vet Microbiol， 2009. 134： 9-14.