RP—HPLC法同时测定藏药手掌参中3种抗AD活性成分的含量

姚晶　林鹏程

摘要 [目的]建立同时测定藏药手掌参中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量测定方法。[方法]采用反相高效液相色谱法（RPHPLC），以ZORBAX SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；进样10 μl；乙腈-浓度0.5%的磷酸水梯度洗脱（0 min，7%；10 min，15%；20 min，20%；25 min，23%；30 min，40%；35 min，40%）；流速为0.7～1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长222 nm。[结果]在35 min内完成对3种抗AD活性成分的分析，各成分之间均达到基线分离。天麻素、dactylorhin A和militarine的线性范围分别为：0.031 34～1.003 00 mg/ml（R=0.999 8）、0.038 06～1.218 00 mg/ml（R=0.999 6）、0.039 28～1.257 00 mg/ml（R=0.999 6）；平均加样回收率（n=6）分别为98.88%、99.91%和100.48%。测定得青藏高原15个不同地区不同种属的手参中3种抗AD活性成分的含量，以互助变异手参的含量最高。[结论]该方法建立的HPLC分析方法简单准确，能快速测定手参中有效成分的含量，青藏高原不同地区不同种属手参中3种抗AD活性成分含量差异较大。

关键词 RPHPLC；手掌参（Gymnadenia conopsea R.Br.）；天麻素；dactylorhin A；militarine；含量测定

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03865-03

Abstract [Objective] To determine the content of gastrodin， dactylorhin A and militarine in Tibetan herb Gymnadenia conopsea. [Method] The sample were separated on the column of ZORBAX SBC18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） which eluted with Acetonitrile（A） and water（B， 0.5% phosphoric acid）. The sample size was 10 μl. The initial condition was 7%A， chsnhrf to 15%A in 10 min， to 20%A in 10 min， to 23% in 5 min， to 40% in 5 min with detected wavelength at 222 nm， flow rate was from 0.7 to 1 ml/min， column temperature at 30 ℃. [Result] Three active constituents were baseisolated. The linear ranges of gastrodin， dactylorhin A and militarine were 0.031 34-1.003 mg/ml （R=0.999 8）， 0.038 06-1.218 mg/ml （R=0.999 6）， 0.039 28-1.257 mg/ml （R=0.999 6） respectively； the average recoveries（n=6） were 98.88%， 99.91% and 100.48% respectively. The content of three AntiAlzheimers active constituents in Tibetan herb Gymnadenia conopsea from fifteen different areas in Tibetan Plateau was determined. [Conclusion] The method is easy and precise which can be used for quantitative analysis of active constituents in Gymnadenia conopsea rapidly. The content of three active constituents changed at a great degree in different species and area.

Key words RPHPLC； Gymnadenia conopsea； Gastrodin； dactylorhin A； militarine； Content determination

手掌参（Gymnadenia conopsea R.Br.）是常用珍稀藏药，味甘、性温，具有增力生精、温肾暖肾、大补元气和安神增智等功效，具有很高的药用价值[1]。天麻素、dactylorhin A和militarine是手掌参中抗AD活性成分的主要有效成分之一[2-4]。由于手掌参入药品种繁多，各地药材品质有较大差异，同时药材有效成分也受海拔、土壤、日照和降水量等环境因素的影响[5]。为了有效控制药材的质量，试验以天麻素、dactylorhin A和militarine为有效药用指标成分，建立青藏高原不同地区手掌参中抗AD活性成分的含量测定的高效液相色谱分析方法，以期为手掌参原药材的质量控制及制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1.1 研究对象。手掌参，经鉴定为Gymnadenia conopsea R.Br.。

1.1.2 主要仪器。FZ102微型植物试样粉碎机，购自北京永光明医疗仪器厂；AL204电子天平，购自Mettler Toledo；Agilent 1200高效液相色谱仪（配置自动进样器，在线脱气机，四元梯度泵，恒温柱温箱，DAD检测器，Agilent 1200色谱工作站），购自Agilent公司；KQ250B型超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。

1.1.3 主要试剂。对照品天麻素。dactylorhin A和militarine，由课题组分离鉴定，纯度>99%；色谱乙腈为高效液相色谱专用试剂，购自山东禹王实业有限公司禹城化工厂；磷酸为AR级，购自天津市红岩试剂厂；水为娃哈哈饮用纯净水，市售。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件。ZORBAX SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，进样10 μl，流动相A为乙腈，流动相B为浓度0.5%磷酸水[5-7]；梯度洗脱程序[8-10]见表1，柱温30 ℃[11]，检测波长222 nm[12-13]。

1.2.2 对照品溶液的制备。分别精密称取天麻素0.100 3 g，用无水甲醇溶于20 ml容量瓶中；取 0.040 6 g dactylorhin A，用无水甲醇溶于10 ml容量瓶中；再取0.041 9 g militarine，用无水甲醇溶于10 ml容量瓶中作为标准储备液。

1.2.3 供试溶液的制备。精密称取手掌参样品粉末1.000 g（过40目筛），置具塞锥形瓶中，精密加入浓度75%的乙醇20 ml，称定重量，65 ℃超声提取3 h，放冷后再称定重量，用浓度75%乙醇补足重量，摇匀，过滤后即得供试品溶液。

1.2.4 方法学考察。（1）系统适应性试验。取对照品溶液和供试品溶液适量，在上述色谱条件下进样，记录色谱图，考察系统适应性。（2）线性关系的考察。分别取4 ml天麻素、6 ml dactylorhin A和6 ml militarine混合于20 ml容量瓶中，充分振荡，再分别取10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 ml上述母液，分别定容于10 ml容量瓶中，得一系列不同浓度的对照品溶液。每次进样10 μl，以浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制3个成分的标准曲线，计算3个组分的回归方程。（3）精密度考察。取天麻素、dactylorhin A和militarine的混合对照品，连续进样6次，每次进样10 μl，计算峰面积的RSD。（4）稳定性考察。精密吸取供试液溶液10 μl，分别在0、2、4、6、12和16 h重复进样6次，测定天麻素、dactylorhin A和militarine色谱峰面积的RSD。（5）重复性试验。取同一批手掌参样品，均匀混合后精密称取6份，每份1.000 g，按“1.2.3”项下制备，分别进样10 μl，记录峰面积，并计算含量和RSD。（6）回收率试验。精密称取已测知含量的手掌参样品1.000 g共9份，分为3组，每组3份，分别添加低、中、高3种浓度的对照品，按“1.2.3”项下操作，测得平均回收率（n=9）和RSD。

1.2.5 样品测定。按“1.2.3”项下方法制备的青藏高原不同地区手掌参样品，以“1.2.1”项下的色谱条件进行分析，以峰面积为标准按外标法计算青藏高原不同地区手掌参样品中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察 （1）系统适应性试验。图1～2表明，在此色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液中3个有效成分的分离效果良好，各峰间无干扰。（2）线性关系的考察。由表2可知，在各自的有效范围内，3个有效成分的浓度与峰面积的线性关系良好。（3）精密度考察。计算得天麻素峰面积的RSD为0.16%，dactylorhin A的峰面积的RSD为0.32%，militarine的峰面积的RSD为0.89%；表明精密度良好。（4）稳定性考察。计算得天麻素、dactylorhin A和militarine面积RSD分别为1.02%、0.69%和1.39%，表明供试品溶液在16 h内稳定。（5）重复性试验。计算得天麻素的平均含量为2.198 4 mg/g，RSD为0.61%，dactylorhin A的平均含量为2.634 9

3.3 流动相的选择 试验用无水甲醇-水、乙腈-浓度0.5%磷酸水溶液、乙腈-水溶液作为流动相，结果显示乙腈浓度0.5%磷酸水溶液为流动相时样品中天麻素、dactylorhin A和militarine分离效果及峰形均较好。

3.4 结论 笔者分别对15批青藏高原不同地区不同种属手参中的天麻素、dactylorhin A和militarine进行了含量测定。测定结果表明，各地区3种活性成分的含量差异较大，其中玉树角盘兰中dactylorhin A和militarine的含量较低，互助北山林场的变异手参各成分的含量均较高，具有较好的药用价值。试验用反相高效液相色谱法同时测定藏药手参中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量，操作简便、快速、可靠，可为藏药手参的质量控制、资源评价等工作提供依据。

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