5个品种柳枝稷愈伤组织的生长特点研究

刘斯佳等

摘要 [目的]通过对5个品种柳枝稷在现有的组培体系下不同的生长特点研究，探讨利用调整培养基配方等方法来实现不同品种的高效再生体系。[方法]采用柳枝稷5个品种Summer、Alamo、Kanlow、Blackwell和CaveinRock的种子为外植体，进行愈伤组织组织培养，对5个品种在诱导、继代、分化、生根以及移栽过程中愈伤组织的生长情况进行比较分析。[结果]在该体系下，出愈率的范围是26.4%～71.2%，最高的是品种Summer，最低的是Alamo。只有Kanlow、Alamo、Summer可以分化出芽，长出植株。分化率最高的是Kanlow，达到60%。[结论]所有品种均能很好生根和移栽；品种Kanlow在该体系下生长最好。

关键词 柳枝稷（Panicum virgatum）；愈伤组织；品种；再生体系

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03819-04

Abstract [Objective] To discuss how to achieve efficient regeneration systems of different cultivars by comparing callus growth characteristics of five switchgrass cultivars under the same culture regeneration system. [Method] Seeds of five cultivars， Alamo， Blackwell， CaveinRock， Kanlow and Summer were used as the explants for callus culture. The analysis and comparisons of the growth characteristics in the process of callus induction， subculture， differentiation， rooting and transplanting were conducted. [Result] Callus induction rate ranged from 26.4% to 71.2%. The callus induction rate of Summer was the highest （71.2%）， while that of Alamo was the lowest（26.4%）. Only callus of Kanlow， Alamo， Summer could be differentiated and grow into plants. Kanlow possessed the highest differentiation rate peaking to 60%. [Conclusion] All the cultivars could root and transplant well. Kanlow grew best in the system.

Key words Switchgrass； Callus； Cultivar； Regeneration system

柳枝稷（Panicum virgatum）属禾本科（Gramineae）黍属（Panicum），原产于北美，是一种多年生暖季型的C4植物。柳枝稷适应性强，具有较高的产量潜力，耐旱耐贫瘠能力较强，而且对环境友好，能够用于生产能源，可以在不适宜其他作物生长的边际土地生长并获得较高的产量[1-2]。因此被国内外许多学者认为是一种发展潜力较大的能源作物[3-4]。

利用植物器官作为外植体建立高效再生体系，是组织培养最直接、最简便和成苗速度最快的途径之一[5]。目前已有多种植物利用芽顶端分生组织[6-11]、茎节[12]和幼穗[13]作为外植体诱导丛生芽，建立了其植株再生体系。以柳枝稷种子为外植体进行愈伤组织再生体系已有成功报道[14-16]，但已有研究基本是以柳枝稷品种Alamo为试验材料，其他品种的报道较为少见。不同品种的组培体系可能差异较大。柳枝稷品种间性状差异较大，特别是不同生态型的品种间[17-18]，因此建立不同品种的组培体系，对于不同品种柳枝稷的分子改良工作具有重要意义。

笔者选择柳枝稷高、低两种生态型共5个品种为材料，在Ruyu Li和Rongda Qu[16]的组培体系下进行研究，比较在该体系下，不同品种在组织培养诱导、继代、分化等阶段的表现；同时对每个阶段表现不好的品种进行分析，通过查阅文献找出改善该品种表现的方法，以期为建立不同品种的高效组培体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。柳枝稷5个品种的种子（购买自美国，2010年收获的种子）为外植体，其中低地型Alamo、Kanlow，高地型为Blackwell、CaveinRock、Summer。

1.2 方法

1.2.1

样品的初处理。将采摘的样品用5%的NaClO溶液处理2.5 h后，用去离子水冲洗3次，隔夜后，使用前再用5%的NaClO溶液处理1.5 h，并用无菌水冲洗3次后使用[19]。

1.2.2

愈伤组织的诱导[16]。采用MS培养基+5 mg/L 2，4D+1 mg/L 6BA+30 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂的配方，每盘培养皿放入25粒种子。5次重复。接种后以25 ℃、暗培养4周，观察并记录出愈的个数。把愈伤组织看成近似球形，通过量取直径来测量愈伤组织大小，每个培养皿选取大中小3个愈伤组织进行测量，并取其平均值。所得结果用Excel2007和The SAS System软件对试验数据进行整理、分析和多重比较等。出愈率（%）=出愈种子数/种子总数×100。

1.2.3

愈伤组织继代培养。配制成分为：MS培养基+5 mg/L 2，4D+1 mg/L 6BA+30 g/L麦芽糖+2 g/L脯氨酸+8 g/L琼脂的继代培养基，将长出的愈伤组织去除芽体后，接种到继代培养基中，继续以25 ℃，黑暗处理的方式培养并观察记录数据。共继代3次以保证愈伤组织的质量及大小。在继代过程中，为保证愈伤组织的大小一致，可对愈伤组织长度超过5 mm的愈伤组织进行适度剪切。

1.2.4

愈伤组织的分化。将继代3次之后的愈伤组织，转入成分为：MS培养基+0.5 mg/L GA+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂分化培养基上，以25 ℃、16 h光照8 h黑暗处理，进行分化。每盘放入15个愈伤组织，及时观察并记录数据。分化率（%）=分化的愈伤组织数/愈伤组织数×100。

1.2.5

愈伤组织的生根。待分化后的绿芽长约1 cm时，即将带有绿芽的愈伤组织转入到1/2MS生根培养基中，进行生根，长成植株。生根率（%）=生根的愈伤组织数/分化的愈伤组织总数×100。

1.2.6

植株的移栽。待生根后的植株株高10 cm左右时，将植株从培养基中移出，用自来水将植株的根洗净，移栽到装有营养土的花盆中，适时浇水，每周观察，目测柳枝稷不同品种植株的高矮、叶片颜色、生活力。移栽率（%）=移栽后存活的愈伤组织数/生根的愈伤组织总数×100。

2 结果与分析

2.1 5个品种愈伤组织的诱导阶段的生长特点

柳枝稷种子在诱导培养基中，3 d后长出芽体和愈伤组织，6 d后部分种子盾片处长出白色水浸状、柔软松散的愈伤组织，并且少量未发芽的种子也有愈伤

组织长出。并且愈伤组织体积逐渐增大。到21 d后，愈伤组织大小基本稳定。愈伤组织形态从松散白色变得紧实致密，大致呈长方体。柳枝稷5个品种的出愈率范围是出愈率的范围是26.4%～71.2%，最高的是品种Summer最低的是Alamo（图1）。

对长出的愈伤组织进行存活率的统计，其中品种Summer为99%，Alamo品种愈伤组织的存活率最低，为82%。通过对愈伤组织大小比较得出，愈伤组织直径平均值最大的是Blackwell品种，为5.132 mm，Summer品种的愈伤组织的平均大小为4.600 mm，Alamo品种愈伤组织直径最小，为3.374 mm（图2）。

2.2 5个品种愈伤组织继代培养阶段的生长特点

2.6 柳枝稷不同品种愈伤组织再生体系的影响因素

品种Alamo和Kanlow是低地型品种，分化率明显高于后3种，因此，该体系更适合低地型品种，而不适用于高地型品种。

试验结果表明，柳枝稷5个品种的愈伤组织生长表现出很大的差异。其中基因型差异可能是5个品种在该体系下表现出差异的重要原因，同时培养基的成分不同对愈伤组织的形成有很大的影响[20-21]。许文志等[14]以MS为基本培养的不同配方建立了Alamo的高效再生体系。另Jason N等[22]的研究采用LP9作为基本培养基，加入植物生长激素建立了品种Alamo的高效再生体系。其他品种的高效再生体系还没有见到相关报道，可以尝试调整培养基成分来实现各品种的再生体系的建立。培养基中无机营养成分Zn、Cu和Fe的含量是影响愈伤组织诱导及分化的重要因素，提高MS培养基中的Fe、B、Zn和Mn的含量可以提高愈伤组织诱导率和分化率，并且提高愈伤组织的质量[23]。

愈伤组织诱导后是先形成松软的愈伤组织，再由松软的愈伤组织形成紧凑的愈伤组织，只有紧凑、干燥的愈伤组织才能分化成苗[24]。因此，提高愈伤组织的质量才能有效提高愈伤组织的分化率。低温预处理小麦幼穗和花蕾外植体可提高花粉愈伤组织产量，预处理温度越低且处理时间越长， 植物对培养反应的抑制作用越大[25]。因此可以尝试对诱导率低的品种如Blackwell等，进行低温预处理来增加出愈率，提高愈伤组织的质量，以及愈伤组织的分化率来完善柳枝稷不同品种愈伤组织培养体系的建立。

3 结论

柳枝稷5个品种的出愈率范围是26.4%～71.2%。出愈率最高的品种是Summer，最低是品种Alamo。愈伤组织直径平均值最大的是Blackwell，为5.132 mm，Alamo品种愈伤组织直径最小，为3.374 mm。5个品种的愈伤组织在继代培养基中可以继续生长，随着继代次数的增加，愈伤组织变得紧凑、干燥，质量有所提高。5个品种的愈伤组织中只有3个品种可以分化出绿芽。Kanlow品种的愈伤组织分化率最高，为60%，Alamo和Summer品种分别达到16.67%和4.76%。分化的愈伤组织在生根培养基中都能100%生长，并且移入花盆中都能很好生长，目测大小、长势、生活力无明显区别。在5个品种中，品种Kanlow分化率最高，出愈率、愈伤组织存活率、愈伤组织大小第4。所以认为Kanlow品种更适合该转化体系。

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