水稻籼粳杂种育性QTL定位及其效应分析

吴建梅 林荔辉 林培清 官华忠 陈志伟 吴为人

摘 要 选用珍汕97B/秀水13的F2代为材料，在育性QTL分析同时，根据育成的亲籼型不育系配组的F1育性分析其QTL效应。结果表明，检测到控制花粉育性的qPF5加性效应值为-8.65，表型贡献率为11.25%。共检测到2个影响小穗育性的QTL（qSF5和qPF6），其中qSF5加性效应为-5.95，表型贡献率为9.11%，与花粉育性qPF5为同一个育性QTL；qSF6加性效应值为-8.55，表型贡献率为16.31%，为广亲和基因S5n。育成的亲籼型不育系的育性QTL（qSF6）来自籼稻等位基因或广亲和基因均可有效提高其籼粳杂种的小穗育性。此外，qSF5对后代小穗育性也有明显效应。籼粳杂种育性不仅与育性QTL有关，且受亲本籼粳成分等因素影响。

关键词 水稻；籼粳交；育性；QTL（数量性状基因座）；效应分析

中图分类号 S511 文献标识码 A

籼粳交后代易产生巨大变异和超亲优势，蕴藏巨大的育种潜力[1]。但其后代存在性状分离世代长、植株过高、生育期长、结实率低、籽粒充实度差等问题，影响了籼粳杂种优势的生产应用[2]，其中F1代育性偏低是亚种间杂种优势利用的主要障碍[3]。因此，深入开展籼粳杂种的育性遗传研究是水稻遗传育种亟待解决的重要课题。目前，已定位了一些与籼粳杂种不育性有关基因，包括S-5、S-7、S-8、S-9、S-15、S-16、S-17、S-26、S-27、S-28、S-29、S-30、S-31、S-32、S-33、S-34和 S-p（t）等广亲和基因与S-a、S-b、S-c、S-d、S-e、S-f等特异亲和基因[4]，且部分基因已被克隆[5-8]。不同籼粳交组合间的不育基因遗传行为不同，控制花粉育性与小穗育性的基因或QTL也存在差异[9]。为克服籼粳交后代育性障碍，提高结实率，1986年，Ikehashi等[10]提出了利用广亲和基因S5n克服籼粳杂种不育性。池桥宏[11]认为广亲和基因可有效解决亚种间杂交稻的育性问题。至今，育种者先后从栽培稻、普通野生稻和尼瓦拉野生稻中鉴定出超过300份携带有S5n的不同类型的稻种材料，并逐渐得以应用[11]。杨杰等[12]、Chen等[6]和仝静飞等[13]对广亲和基因S5n的分子进化及功能开展了深入研究，揭示该基因克服育性障碍的主要机理。在籼粳杂种优势利用上，袁隆平[14]首次提出了籼粳亚种间杂种优势利用的设想，认为利用亚种间杂种优势是突破产量的有效途径，并提出了应用广亲和基因与光温敏核不育基因实现亚种间杂种优势的设想。杨振玉等[15]利用“籼粳架桥亲和”的育种方法，育成广亲和粳型恢复系C418。程式华等[16]提出了可在现有籼型杂交稻的基础上，增加一定比例的粳稻“血缘”以提高杂交稻的产量水平。张桂权和卢永根[17-18]则提出采用“特异亲和基因”培育“粳型亲籼系”，使之与籼稻配组的杂种结实率提高至正常水平，充分发挥籼粳杂种优势，并由此建立了粳型亲籼系分子育种体系，为大规模选育粳型亲籼系奠定基础[19-20]。万建民[21]通过广亲和基因聚合育种及分子标记辅助育种技术，先后育成了协优107和粳稻光温敏不育系509S等。但籼粳杂种育性是一个复杂性状，仅导入广亲和基因或特异性亲和基因并不能完全解决籼粳交F1代的育性问题，还需考虑微效基因及基因间的互作等因素[22]。影响籼粳杂种育性的遗传模型是多样化的，特定的杂交组合可表现出等位基因互作或非等位基因互作等各种形式，且受环境因素影响[23]。

本研究以珍汕97B/秀水13的F2群体为材料，对籼粳杂种育性QTL进行分析。利用该F2群体为育种材料，经多代回交，育成系列亲籼型三系不育系（即含有粳稻成分，与籼稻恢复系杂交F1代育性正常）[24]，分析其籼粳遗传背景，判断育性等位基因来源，结合F1代的育性表型，分析育性QTL效应，为亲籼型不育系选育与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料包括籼型保持系珍汕97B（母本）和粳稻品种秀水13（父本）及其F1、F2。以该F2群体为育种材料，采用系谱法，经5年8代回交转育，育成了7个亲籼型三系不育系A126、A132、A136、A152、A164、A180和A182。以Ⅱ-32A为对照，采用闽恢3301、明恢86、明恢63、蜀恢527、R1577、T2070等为父本，按8×6不完全双列杂交（NC-Ⅱ）方式组配48个F1代，分析育性QTL效应。

1.2 材料种植与性状调查

2007年早季在福建莆田种植亲本、F1、F2遗传群体，其中亲本、F1种植49株，F2群体种植2000株。6月15日起开始抽穗后，对亲本和F1、F2的花粉育性与小穗育性进行调查，同时在F2群体中随机选取176株提取DNA，用于遗传作图与育性QTL定位。

2009年晚季在泰宁种植不完全双列杂交设计的亲本与F1代，随机区组设计，3次重复，小区种植42株，单本插植，株行距20.0 cm×20.0 cm。试验地肥力均匀，田间栽培管理一致。

花粉育性观察具体方法如下：在抽穗期，于8：00左右，每株取3穗，每穗取当日开花颖花5朵，混合制片，然后用1%的I2-KI染色镜检。花粉育性以可育花粉的百分率表示，取平均值。在成熟期，每株取5穗考察小穗育性（即结实率），取平均值。

1.3 分子标记检测

采用SDS方法提取亲本及176个F2单株的DNA。水稻SSR标记及ILP标记引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。依据McCouch等发表的SSR标记连锁图[25]，筛选在亲本间具多态性且覆盖水稻基因组的SSR引物，检测F2单株的基因型。将亲本秀水13的带型记为1，珍汕97B的带型记为2，杂合带型记为3，缺失数据记为0。采用ILP标记分析珍汕97B与秀水13的籼粳成分指数[26]。并采用SSR标记分析各不育系的籼粳成分遗传背景。

1.4 数据分析

遗传作图与QTL定位：花粉育性和小穗育性百分数经反正弦转换后用于统计分析。利用Mapmaker/EXP 3.0软件[27]构建分子标记连锁图，采用QTLNetwork 2.0软件[28]进行QTL定位。总体显著水平设为5%，通过置换测验（permutation tests）估计相应的显著阈值，当F统计量峰值超过阈值时，即认为峰值对应的染色体位置存在1个QTL。应用McCouch等[29]方法对QTL命名。

育性效应分析：根据育性QTL定位结果检测亲籼型不育系育性等位基因来源、籼粳成分含量、和籼粳交F1育性表型等，进行育性QTL效应分析。

2 结果与分析

2.1 构图亲本及F1、F2的育性表现

珍汕97B（P1）、秀水13（P2）及其F1的花粉育性分别为97.5%、97.1%和91.5%，小穗育性分别为94.8%、87.2%和53.3%。亲本育性正常，而F1则出现育性障碍。F2代群体的花粉育性和小穗育性均呈连续分布，为数量性状的遗传特点（图1）。花粉育性与小穗育性相关系数为0.568 8，达极显著水平，说明花粉育性是决定小穗育性的主要因素，两性状有着共同的遗传基础（图1）。

2.2 QTL定位

珍汕97B和秀水13亲本间的SSR引物多态比率为57.46%。选用其中131对SSR多态引物对亲本和176个F2单株进行基因型检测，构建分子遗传连锁图谱。该图谱总长1 921.0 cM，标记间平均距离为14.7 cM，较均匀的分布在水稻12条染色体上，可满足后代育性QTL分析的要求。

花粉育性和小穗育性在5号染色体同一位置上检测到qPF5和qSF5，位于RM305-RM26区间（表1），以加性效应为主，且表型效应模式相似，来自秀水13的等位基因对花粉育性和小穗育性表现为负效应。由于花粉育性与小穗育性呈正相关，因此推测它们可能是同一个QTL（图2）。小穗育性在6号染色体上检测到以加性效应为主的qSF6，表型贡献率达16.31%，来自秀水13的育性基因有降低小穗育性的效应，该QTL与前人报道的广亲和基因S5n位置一致（表1），由此推断其为广亲和基因S5n。此外，本试验在花粉育性还检测到1对QTL间的互作。即4号染色体RM551-RM335区间与8号染色体RM152-RM310区间的两个QTL间互作，其加性-显性互作及加性-加性互作效应值分别为27.87和17.89，但表型贡献率均小于1.5%。

2.3 育性QTL效应分析

2.3.1 F1代的育性表现及籼粳遗传成分相关 采用上述7个亲籼型不育系与6个籼型恢复系组配42个F1代，其中A126、A132、A136等3个不育系与6个恢复系的杂交组合中，共有16个组合小穗育性达77%以上；A152、A164配制的F1代小穗育性除了A164/明恢86小穗育性达79.09%外，其余组合小穗育性均偏低，且变异系数大。A180、A182除与T2070的F1代小穗育性偏低外，所配制的其它组合均达80%以上，接近II-32A配组后代的育性水平（表2）。采用38对ILP标记分析结果表明，珍汕97B籼稻成分指数为94.5%；秀水13粳稻成分指数为81.1%。采用均匀分布于12条染色体的88个SSR标记分析7个不育系籼粳成分背景，结果表明：A126、A132、A136、A152、A164、A180和A182含有秀水13的遗传成分分别为50.76%、48.18%、69.15%，76.70%、77.73%、37.19%和23.77%。不育系的籼粳成分与其配制的F1花粉育性与小穗育性间的相关系数分别为0.741和0.749，均达极显著水平，表明不育系中的秀水13成分越高，其配组的F1育性就越低。F1育性不仅受育性QTL控制，也与亲籼型不育系的籼粳成分含量有关。

2.3.2 育性QTL分析 珍汕97B/秀水13的F1代花粉育性正常，F2群体的花粉育性趋向高值（图1），表明小穗育性是影响该组合籼粳杂种不育的主要原因，其也是水稻育种上选择的主要依据，故本研究小穗育性作为分析重点。

小穗育性qSF5与qSF6（S5n）的效应值与表型贡献率均以加性效应为主，来自秀水13的等位基因降低后代的小穗育性，且后者的效应值与表型贡献率高于前者（表1）。根据定位的育性QTL两端标记分别检测上述不育系的育性等位基因来源，可将7个亲籼型不育系分为4种类型（表3）：Ⅰ类型如A180和A182，即qSF5和qSF6均来自珍汕97B的等位基因，两不育系与系列籼型恢复系配组的F1代小穗育性平均值分别为80.55%和79.12%；Ⅱ类型如A126和A132，即qSF5座位上来自籼稻珍汕97B的育性等位基因提高了F1小穗育性；qSF6两端标记RM402为秀水带型，RM539为珍汕97B带型，该座位来源存在两种可能，即籼稻等位座位（S5i）或广亲和基因（S5n），两不育系与籼稻恢复系配组F1代的育性配子组合存在S5iS5i或S5iS5n两种可能，5、6号染色体上的育性QTL均使其与籼型恢复系配组的F1育性表现正常；Ⅲ类型如A136：qSF5座位上来自秀水13的等位基因使小穗育性下降；qSPF6的等位基因来自籼稻珍汕97B，由于qSF6效应值高于qSF5，F1小穗育性趋于正常（76.61%）；Ⅳ类型如A152和A164：存在广亲和基因qSF6，但qSF5来自秀水13的等位基因使小穗育性降低，在与籼稻恢复系配组时，F1小穗育性平均值分别为58.26%和68.18%，仍存在育性障碍。

各类型小穗育性方差分析表明（表3）：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类型的F1代小穗育性均有一定的差异，表明小穗育性不仅受育性QTL控制，还与籼粳成分含量、微效基因及QTL间互作有关；Ⅳ类型F1代育性明显下降，比较Ⅲ与Ⅳ类型，在qSF5座位上来自秀水13的等位基因使小穗育性下降的相同条件下，携带S5i育性基因的不育系与籼型恢复系配组的杂种一代育性明显高于携带S5n的不育系所配杂种小穗育性。

3 讨论

3.1 籼粳交后代育性遗传基础复杂

控制籼粳杂种育性的遗传基础十分复杂，不同的籼粳交组合涉及的杂种育性基因存在较大差异[30]。本研究共检测到控制花粉育性和小穗育性3个QTL，其中余传元[30]、宋翔[31]、井文[32]、刘永胜[33]等均在qPF5和qSF5的相近区域检测到影响花粉育性和小穗育性的相关QTL。影响小穗育性的qSF6（即广亲和基因S5n）已有大量的报道[22]。育性QTL并不能完全解释F2群体中所有的表型变异，其余的表型变异则可能由微效基因、基因上位性或环境互作效应引起。宋翔[31]、Wang等[34]、Li等[35]等在不同的群体均发现不同QTL存在复杂的互作，且认为互作是影响籼粳杂种花粉育性的重要原因。林荔辉等[36-37]比较了浙江粳稻（秀水13）和北方粳稻（辽91B）分别与珍汕97B构建的两个遗传群体的育性QTL定位结果，表明因南北粳稻的遗传背景不同，两群体花粉育性QTL效应不同；在小穗育性上除了5号和8号染色体小穗育性QTL差别外，在6号染色体上同一位置（在RM402附近）检测的育性QTL，珍B/秀水13群体为广亲和基因，而珍B/辽91B群体在该座位的QTL以显性效应为主，基因杂合降低了F1小穗育性。

Chen等[6]和仝静飞等[13]的研究结果表明，S5n 由于缺失了136 bp，导致其表达产物在N端缺少了一段具有引导作用的肽链，使其表达产物无法正常转运而沉积在胞内，从而丧失功能，不与S5i表达产物或S5j表达产物互作，所以杂种的胚囊可育。本研究结果表明广亲和基因S5n的正效应低于籼稻育性等位基因S5i，即F1代的小穗育性效应S5iS5i>S5iS5n。qSF6的效应值及贡献率明显高于qSF5，该座位上的S5iS5i基因可在一定程度上掩盖qSF5上来自秀水13育性等位基因的负效应，提高后代小穗育性。含有广亲和S5n的株系中，来自秀水13等位基因qSF5仍可导致了F1代小穗育性障碍（如A152、A164），表明广亲和基因可提高籼粳交F1的小穗育性，但并不能完全解决育性障碍问题，这与Liu等[38]认为即使有S5n存在，其它的微效修饰基因等共同作用也能导致杂种不育的结论是一致的。因而，在利用广亲和基因进行水稻遗传改良时，不仅要考虑广亲和等主效育性基因聚合与导入，还须对其它育性微效基因及基因间互作等因素加以重视，而不能把复杂的亚种间育性简单化[30]。

3.2 籼粳交后代育性遗传分析在育种上的应用

育种实践表明， 籼粳基因渐渗在超级杂交稻育种中发挥了重要作用， 育种上很多超级杂交稻的亲本均通过籼粳基因渐渗获得[16]。从育种角度看，用籼粳中间型不育系比用籼粳中间型恢复系组配强优势亚种间组合的几率大，但选育难度也更大[39]。目前，在粳型细胞质雄性不育系上先后育成了高异交率偏粳型广亲和不育系春江19A[40]及强配合力甬粳2号A[41]等，并育成春优618[42]及甬优6号[43]、甬优9号[44]等强优势组合在生产上应用。本研究从亲籼型不育系选育的育性角度出发，拟在粳稻成分背景下，将育性QTL的所有座位等位基因替换为籼稻育性座位（即理想的粳型亲籼系），快速培育系列亲籼型不育系，以此与籼稻恢复系配组的F1代育性恢复正常，达到有效利用籼粳交杂种优势的目的。通过系谱法育成的亲籼型不育系的粳稻遗传成分变幅为23.77%～77.73%，所配组的42个籼粳交F1中，其中18个杂交组合小穗育性正常，达80%以上，另有5个组合达77%以上，达到了预期育性目标；但含有广亲和基因且粳稻成分占76%以上的A152、A164所配组合中，除了A164/明恢86小穗育性达79.09%外，其它组合小穗育性均较低，因此，在采用含有广亲和基因的育种材料进行遗传改良时，还需对其它相关的育性QTL及后代籼粳遗传背景综合考虑，方可获得理想的育种材料。至于籼粳基因渐渗的比例大小与籼粳杂种优势的关系，仍有待于进一步的研究。

参考文献

[1] 杨守仁. 籼粳稻杂交育种的进展及前景[J].中国农业科学， 1986， 19（5）： 15-18.

[2] 王建军， 徐云碧， 申宗坦. 利用籼粳杂种一代若干问题的探讨[J]. 中国农业科学， 1991， 24（1）： 27-33.

[3] 杨守仁. 籼粳稻杂交育种研究[J]. 遗传学通讯， 1973（2）： 34-38.

[4] 钟铮铮. 水稻籼粳亚种间杂种花粉不育基因的精细定位及进化分析[D]， 南京： 南京农业大学， 2010.

[5] 苏 菁， 刘耀光. 栽培稻（Oryza sativa L.）亚种间F_1花粉不育基因S-a的精细定位及克隆[J].分子植物育种， 2003（5/6）： 757-758.

[6] Chen J J， Ding J H， Ouyang Y D， et al. A triallelic system of S5 is a major regulator of the reproductive barrier and compatibility of indica-japonica hybrids in rice[J]. Proc. Natl. Acad. Sci.， USA， 2008， 105（32）： 11 436-11 441.

[7] 李文涛， 曾瑞珍， 张泽民， 等.水稻发1花粉不育基因座S-b 的精细定位[J]. 科学通报， 2006， 51（4）： 404-408.

[8] 杨存义， 陈忠正， 庄楚雄， 等. 水稻籼粳杂种不育基因座S-c的遗传图和物理图精细定位[J]. 科学通报， 2004， 49（13）： 1 273-1 277.

[9] 严长杰， 梁国华， 顾世梁， 等. 水稻籼粳杂种不育性及其类型[J]. 作物学报， 到2003， 29（4）： 574-580.

[10] Ikehashi H， Araski H. Geneyics of sterility in remote crosses of rice[J]. Rice Genetics IRRI， 1986： 119-130.

[11]池桥宏， 荒木均， 姜 涛. 在水稻远缘杂交中控制F1不育性的复等位基因[J]. 北方水稻， 1989（2）： 40-45.

[12] 杨 杰， 王 军， 曹 卿， 等. 水稻广亲和基因S5-n的功能标记开发及其应用[J].作物学报， 2009， 35（11）： 2 000-2 007.

[13] 仝静飞， 李艳红， 杨有新， 等.水稻S5n基因的分子进化及功能比较[J]. 科学通报， 2011， 56（15）： 1 204-1 212.

[14] 袁隆平. 选育水稻亚种间杂交组合的策略[J]. 杂交水稻， 1996（2）： 1-4.

[15] 杨振玉， 张忠旭， 罗治华， 等. 杂交水稻 “籼粳架桥” 骨干亲本的培育与杂种优势生态群的利用[G]. 第1届中国杂交水稻大会论文集， 2010： 64-67.

[16] 程式华， 曹立勇， 庄杰云， 等.关于超级稻品种培育的资源和基因利用问题[J]. 中国水稻科学， 2009， 23（3）： 223-228.

[17] 张桂权， 卢永根. 栽培稻（Oryza sativa L.）杂种不育性的遗传研究： Ⅱ. F1花粉不育性的基因模式[J]. 遗传学报， 1993， 20（3）： 222-228.

[18] 张桂权. 栽培稻（Oryza sativa L.）杂种不育性的遗传研究[D]. 广州： 华南农业大学， 1991.

[19]丁效华， 陈跃进， 杨长寿， 等. 水稻粳型亲籼系亲和性的测定[J]. 中国水稻科学， 2002， 16（4）： 366-368.

[20]丁效华， 陈跃进， 杨长寿， 等. 水稻粳型亲籼系粳型性的判别[J]. 中国水稻科学， 2003， 17（1）： 21-24.

[21] 万建民. 水稻籼粳交杂种优势利用研究[G]. 第1届中国杂交水稻大会论文集， 2010： 3-6.

[22] 李晓玲. 水稻籼粳亚种间杂种不育性的研究进展[J]. 中国农学通报， 2004， 20（5）： 45-49.

[23] 杜红毅. 水稻籼粳不育基因的自然变异、 进化模式与功能分析[D]. 武汉： 华中农业大学， 2011.

[24] 吴建梅， 林荔辉， 吴为人， 等. 水稻籼粳交亲籼型不育系的杂种优势利用[J]. 福建农林大学学报（自然科学版）， 2012， 41（1）： 1-6.

[25] McCouch S R， Kochert G， Yu Z H， et al. Molecular mapping of rice chromosomes[J]. Theor Appl Genet， 1988， 76： 815-829.

[26]许旭明， 梁康迳， 张受刚， 等. 利用ILP标记分析水稻籼粳杂交亲本和衍生系的籼粳分化[J].中国农业科学， 2009， 42（10）： 3 388-3 396.

[27] Stuber C W， Lincoln S E， Wolff D W， et al. Identification of genetic factors contributing to heterosis in a hybrid from two elite maize inbred lines using molecular markers[J]. Genetics， 1992， 132： 823-829.

[28] 杨 剑， 朱 军. 复杂性状遗传分析方法研究及其软件开发[D]. 杭州： 浙江大学， 2008.

[29] McCouch S R， Cho Y G， Yang M， et al. Report on QTL nomenclature[J]. Rice Genetics New sletter， 1997， 14： 11-13.

[30] 余传元， 赵志刚， 陈平等.籼粳亚种间杂种育性相关基因座全基因组分析[J]. 作物学报， 2007， 33（4）： 547-553.

[31] 宋 翔. 水稻籼粳亚种间杂种不育机理的研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2005.

[32] 井 文. 水稻籼粳亚种间杂种不育性的遗传分析[D]. 南京： 南京农业大学， 2004.

[33] 刘永胜， 朱立煌， 孙敬三， 等. 水稻籼粳杂交胚囊败育的遗传分析和基因定位[J]. 中国科学（C辑）， 1997， 27（5）： 421-425.

[34] Wang J， Liu K D， Xu C G， et al. The high level of wide-compatibility of variety Dular has a complex genetic basis[J]. Theor Appl Genet， 1998， 97： 407-412.

[35] Li Z， Pinson S R M， Paterson A H， et al. Genetics of hybrid sterility and hybrid breakdown in an intersubspecific rice（Oryza sativa L.）population[J]. Genetics， 1997， 145： 1 139-1 148.

[36] 林荔辉， 王爱梅， 周元昌， 等. 水稻籼粳杂种育性的QTL分析[J]. 中国水稻科学， 2011， 25（6）： 594-598.

[37] 林荔辉. 应用分子和常规技术通过籼粳交选育亲籼型水稻雄性不育系[D]. 福州： 福建农林大学， 2010.

[38] Liu K D， Wang J， Li H B， et al. A genome wide analysis of wide compatibility in rice and precise location of the S5 locus in the molecular map[J]. The Appl Genet， 1997， 95： 809-814.

[39] 陈深广， 曹立勇， 斯华敏， 等.水稻籼粳交衍生不育系的籼粳属性鉴定及配组F1优势初探[J]. 中国水稻科学， 2010， 24（6）： 667-671.

[40] Lin J R， Song X W， Wu M G， et al. Breeding and Utilization of Japonicalinous CMS Line Chunjiang 19A with Wide Compatibility and High Outcrossing Rate[J]. Agricultural Science & Technology， 2012， 13（3）： 537-540.

[41] 马荣荣， 王晓燕， 陆永法， 等. 晚粳不育系甬粳2号A及其籼粳杂交晚稻组合的选育及应用[G]. 第1届中国杂交水稻大会论文集， 2010： 185-189.

[42 ] Wu M G， LIN JR ， Song X W， et al. Breeding of New Japonica-indica Hybrid Rice Combination--Chunyou 618A[J]. Agricultural Science & Technology， 2012， 13（8）： 1 691-1 694.

[43] 张 胜， 林太赟， 王 威. 杂交水稻 ‘甬优6号 高产高效技术途径分析[J]. 中国农学通报， 2011， 27（7）： 144-146.

[44] Zhang S， Lin T Y. Correlation Regression and Path Analysis between Yield Triaits and Yield of Yongyiu NO9[J]. Agricultural Science & Technology， 2011， 12（4）： 517-519.