紫锥菊多糖对LPS损伤后IEC—6细胞分泌IL—1ɑmRNA的影响

关景林

摘 要：为了研究紫锥菊多糖对LPS损伤后IEC-6细胞分泌IL-1α mRNA的影响，以体外培养大鼠小肠上皮细胞为模型，进行细胞分组及收集，并给予LPS刺激造成内毒素损伤，根据GenBank中发布的IL-1ɑ基因序列设计引物，以基因组RNA为模板进行RT-PCR扩增，发现紫锥菊多糖对LPS刺激小肠上皮细胞产生的IL-1α mRNA的表达减少。

关键字：紫锥菊；IL-1；PCR；IEC-6

紫锥菊（Echinacea purpurea）药用历史可追溯到北美印第安人时期，该属植物被印第安人作为治疗外伤、蛇咬、头痛及感冒的最佳药物[1]。在北美和欧洲紫锥菊也曾作为传统抗感染、抗炎药物使用。紫锥菊的多糖部分及异丁酰胺部分有免疫调节的功能，可阻止病原体引起的炎症，有较强的抗炎活性 [2～5]。在我国，紫锥菊于上世纪70 年代开始引入。 由于引种时间短，相关研究较少，但已引起广泛关注。目前，北京、天津、湖南、陕西、广西、四川等省市都有厂家生产紫锥菊根乙醇提取物[6]。本研究对紫锥菊根乙醇提取物的抗炎作用进行初步探讨。

紫锥菊主要是通过激活不同的免疫细胞来提高人体自身免疫，促进干扰素和抗体的产生[7]，而增强机体对细菌和病毒感染的抵抗力，能够刺激单核淋巴细胞的增殖和巨噬细胞的活性，使巨噬细胞释放肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白细胞介素（IL-1、IL-6）和干扰素B2，可诱导抵抗不同的DNA和RNA病毒的感染，用来治疗和预防各种疾病。紫锥菊含有多种化学成分，包括多糖（polysaccharides）、多种烷基酰胺类化合物（alkylam·ides）、咖啡酸类衍生物（caffoylphenos）、黄酮类、挥发油，等等[8]。在药理方面研究较多的是多糖，对提高机体免疫力，抗病毒，治疗流感，抗菌，消炎，抗感染有显著效果[9]，主要用于治疗感冒、咳嗽、支气管炎和上呼吸道感染及其它因素引起的感染。因此，本文拟对紫锥菊多糖对LPS损伤后IEC-6分泌IL-1α mRNA的影响进行研究。为研究紫锥菊多糖的抗炎、抗感染的作用机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验试剂

核酸染料Gold view：东盛生物有限公司

逆转录试剂盒：美国GeneCopoeia公司

Trizon：康为世纪

2×Taq MasterMix：康为世纪

DL2000DNA Marker （100-2，000）：Takara公司

1.2主要仪器

台式高速离心机（Anke TGL-16G）；FA20048电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；SZ-93A自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；BIO-BEST200E凝胶成像仪（JYOZG JUNYI 北京尹意东方电泳设备有限公司）；EDC-810型基因扩增仪（东盛创新生物科技有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1 细胞培养

IEC-6细胞从正常大鼠小肠隐窝细胞分离出来并经体外培养传代而建立起来的细胞株，保持了小肠上皮干细胞未分化的特性，在组织学或免疫学方面与隐窝细胞无明显差别。对冻存的IEC-6细胞进行复苏。将细胞冻存管置于37℃水浴中，使冻存管中的冻存物在1 min内融化。细胞解冻后，迅速从水浴中取出，用70%酒精消毒冻存管，并迅速转入无菌操作台。打开冻存管，将冻存管中的细胞转入含培养液的培养瓶中；培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养基，配以0.01 mg/mL胰岛素，在CO2培养箱（5%CO2）中培养。次日换液，至80%融合时，0.25%胰酶消化传代，5 d传代一次，传代5次后的细胞用于实验分组。

1.3.2细胞分组

将培养的细胞分为6组 对照组：以GAPDH为对照； LPS组：浓度为10 ug/mL； APS50 μg/mL+LPS组；APS100 μg/mL+LPS组；APS200 μg/mL+LPS组；APS500 μg/mL+LPS组。

1.3.3细胞收集

IEC-6细胞在DMEM培养基中加入不同浓度的紫锥菊多糖（50 μg/mL；100 μg/mL；200 μg/mL；500 μg/mL）培育24 h，给予LPS（10 μg/mL）刺激1 h后，收集细胞，分别给LPS（10 μg/mL）刺激1 h和4 h后，收集细胞，备用。

1.3.4细胞总RNA提取

吸取单层细胞培养液，加入适量TRIzon，每10 cm2面积需要1 mLTRIzon，反复吹打使细胞裂解，如果TRIzon量不足可能导致RNA中有DNA污染；样品中加入TRIzon后反复吹打几次，使样本充分裂解，冰上放置5 min，使蛋白核酸复合物完全分离；向以上溶液中加入氯仿（每使用1 mLTRIzon加入0.2 mL氯仿），盖好管盖，剧烈震荡15 s，冰上放置2～3 min；4 ℃ 12000 rpm离心15min，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相（约600 μL）转移到一个新的RNase-Free离心管（自备）中；在得到的水相溶液中加入等体积乙丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。4 ℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清；75% 乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀，每使用1mL TRIzon 用1 mL 75%乙醇对沉淀进行洗涤。4 ℃ 12000 rpm离心3 min，小心吸取上清，注意不要吸取沉淀；室温放置2～3 min，晾干，加入50 μL无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃。

1.3.5 逆转录反应

2.3.8 琼脂凝胶电泳

1%琼脂糖凝胶电泳：1% 琼脂糖+0.5×TAE至体积50 mL，（以DL2000为DNA Marker）每孔加样5 μL，以DL2000为DNA Marker 加样3 μL，120V电泳30 min左右，在凝胶成像系统下观察结果。

2结果与分析

2.1紫锥菊多糖抑制了LPS刺激IEC-6细胞分泌IL-1ɑ mRNA产物的表达

RT-PCR分析方法检测显示，当LPS刺激IEC-6细胞时，IL-1α mRNA被诱导分泌具有显著意义的增加。而紫锥菊可以抑制这种作用，并且具有剂量依赖性，50 μg/mL紫锥菊可以部分抑制LPS刺激IEC-6产生的IL-1α mRNA水平，而200 μg/mL及500 μg/mL紫锥菊随着浓度的增加，其抑制IL-1α mRNA的水平逐渐增加，如图1。

2.2紫锥菊多糖具有时间依赖性的抑制LPS刺激IEC-6细胞产生IL-1ɑ mRNA水平的表达

本文采用了将IEC-6细胞用500 μg/mL紫锥菊预处理24h，然后用LPS（10 ug/mL）刺激达1 h及4 h，采用RT-PCR方法进行IL-1α mRNA分析，LPS诱导IL-1α mRNA表达被紫锥菊有效的抑制，如图1。

3讨论

IEC-6是从正常大鼠小肠隐窝细胞分离出来并经体外培养传代而建立起来的细胞株，在合适条件下分化为成熟的肠上皮细胞。肠上皮细胞是肠道黏膜屏障的重要组成部分，同时被认为在宿主表面的天然及获得性系统免疫中起中心调节作用，是宿主与病原微生物双向联系的第一道防御。一些肠道疾病和非肠道疾病均可引发肠功能障碍，各种应激状态时，全身免疫功能下降，肠道内细菌和内毒素LPS侵入体循环和肠组织内，造成细菌移位和肠源性内毒血症，从而进一步加剧肠上皮细胞的损伤，激活细胞内一系列的免疫反应，导致一些炎症介质如IL-1等的产生和释放，引起全身炎症反应[10]。在LPS作用下，肠道上皮细胞NF-κB可被激活，高效诱导多种细胞因子（IL-1α），黏附因子，趋化因子和急性期反应蛋白的基因表达增加[11]。

国内路景涛[12]研究证实黄芪多糖能够抑制细菌脂多糖诱导大鼠腹腔巨噬细胞释放的白细胞介素的分泌，说明黄芪可以通过抑制炎症因子的分泌从而减少组织细胞的损伤来发挥其对机体的免疫保护作用。研究证实，紫锥菊对正常IEC-6细胞具有促进细胞增殖作用，当LPS刺激IEC-6时，IL-1α的表达增加，当细胞受到LPS损伤时，紫锥菊却不能呈现出显著的促增殖作用，提示紫锥菊的促细胞的增值作用有赖于细胞处于正常的生理状态。紫锥菊能够抑制细菌脂多糖诱导IEC-6细胞释放IL-1α的分泌，可以抑制炎症因子的分泌，并且紫锥菊对这种因子的抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性，从而减少组织细胞的损伤来发挥其对机体的免疫保护作用。

4结论

4.1 LPS作用于小肠上皮细胞后，其分泌的细胞因子IL-1α mRNA产生增多，而紫锥菊多糖可以抑制LPS刺激细胞分泌的IL-1α mRNA的产生，从而起到肠道黏膜的保护作用。这种抑制作用具有浓度及时间依赖性。

4.2 紫锥菊多糖对小肠上皮细胞的免疫保护作用可能是通过抑制细胞因子IL-1α过量表达，从而减少其对组织细胞的炎性损伤。

（编辑：何芳）

参考文献：

[1] 李 伟 ，郭 腾.陈洪亮，等.紫锥菊研究进展及在动物保健上的应用展望[J].兽药与饲料添加剂，006，11（3）：28.

[2] 王康才，唐晓清，朱光明，等.紫锥菊属植物的化学成分、药理及开发利用研究进展[J]. 中药材，2000，23（12）：780.

[3] 洪纪宪.神奇紫锥菊-21世纪咽喉炎感冒克星[J].北京：中国古籍出版社，2004：2.

[4] Dieter M，Ellen W， Klaus L， et al. Echinacea Root Extracts for the Prevention of Upper Respirator y Tract Infections[J].Arch Fam Med，1998，7（6）：541.

[5] 肖培根.国际的流行免疫调节剂-紫锥菊及制剂[J].中草药，1996，27（1）：46.

[6] 窦德明，崔树玉，曹永智，等.引种紫锥菊有效成分菊苣酸含量研究[J].中草药.2001，32（11）：987.

[7] 卢贺起，丁家欣，，魏雅川.紫草多糖粗提物的药效作用研究[J].中国药理学会通讯，2000，17（4）：26-27.

[8] 帅冬华.紫草中化学成分及药理作用的研究进展[J].中外医疗，2009，28（22）：103-104.

[9] 张英涛，王弘.松果菊属药用植物的应用基础研究[J].北京大学学报（ 医药版），2004，36：90-93.

[10] 吴江涛，刘珂.紫锥菊提取物对小鼠单核巨噬细胞系统功能的影响[J].烟台大学学报（自然科学与工程版），2001，14（2）：131- 134.

[11] 梁君山，魏伟，周爱武，等.白细胞介素-1的检验及白芍总苷对其产生的影响[J].中国药理学通报，1989，5（6）：353-357.

[13] Cerezo CS，Kulpa-Oliver V. RegUlation of adoleseent rat intestinal epithelial indueible nitric oxide synthase in endotoxin tolerance：modulation of signal transduetion.Shoek.2004 May；21（5）：476-83.