人羊膜间充质干细胞促进创面修复及其作用机制

吴中桓 孙广峰 金文虎

严重创伤、大面积深度烧伤、慢性难愈性创面等的修复是一个复杂而重要的问题，随着间充质干细胞（MSCs）研究的不断深入，MSCs的应用为复杂创面修复提供了新的方法。表皮干细胞（ESCs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）、人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells， hAMSCs）等多种MSCs被用于创面修复的研究，研究证明，这些MSCs有促进创面愈合的作用。在脐带血、骨髓、外周血及脂肪等组织器官中存在多分化功能MSCs，由于伦理问题、来源有限、对机体损伤、致瘤性等多种因素限制了其在再生医学领域中的应用。hAMSCs具有高度自我更新能力，易于体外培养及扩增，免疫原性低、无致瘤性及多分化潜能强等特点，且人羊膜是隔离胎儿和母体的一层隔膜，是产后废弃物，基本不涉及伦理道德问题，取材方便、来源充足，无血管、神经、淋巴等，使其在再生医学领域中的意义更为深远[1]。创面修复是烧伤整形外科常见的难题，目前临床常用的创面修复方法存在治疗时间长、大面积烧伤患者皮源不足、瘢痕增生明显、皮瓣移植术后部分或全部坏死及皮瓣术后感觉功能恢复差等问题。随着人们对hAMSCs研究的不断深入，用其来促进创面愈合、预防瘢痕增生、促进皮瓣存活及改善皮瓣术后感觉功能是一种有前景的治疗方法之一。

1 hAMSCs的分离培养及鉴定

hAMSCs来源于外胚层的羊膜上皮细胞和中胚层的间充质细胞[2]，其分离、培养及鉴定尚无统一方案。以往用机械法成功地从人羊膜分离到hAMSCs[3]。目前多用胰蛋白酶-胶原酶消化法获取hAMSCs。hAMSCs与BMSCs有相似的形态特征，原代细胞呈梭形、圆形、星形或多角形，传代培养后一般变均匀一致，细胞表现为成纤维细胞样，梭形、排列紧密，放射状或漩涡状贴壁生长。电镜观察发现hAMSCs有与肠道上皮细胞不一样的微绒毛，胞浆内有丰富的中间丝、脂质小滴及空泡，中等量的高尔基复合体、粗面内质网、线粒体和致密体，细胞或突起间可见细胞连接结构。

hAMSCs与BMSCs、ADSCs有相似的表面标志抗原。流式检测hAMSCs表达间质细胞标记CD73、CD90、CD166和CDl05，不表达造血和内皮标记CD34、CDl4、CD28、CD45、CD117和HLA-DR，表达CD49b、CD29及CD49d等整合素家族成员及CDl3、CD44、CD51、CD59、Vimentin、Nestin等间充质干细胞特征性表面标志蛋白。hAMSCs还表达胚胎干细胞表面标记物SSEA-3和4、OCT-4、KIF4、Sox2、Nanog，这表明其有自我更新及多分化潜能[1，4]。hAMSCs的FCM检测不表达MHC-II类抗原HLA-DR、刺激分子CD80（B7-1）及CD86（B7-2）等，表明其具有免疫耐受特性[5]。实验中对其进行成骨成脂诱导，经成骨诱导的细胞茜素红染色阳性，经成脂诱导的细胞油红染色阳性，这证实了hAMSCs与其他组织来源的MSCs具有相似的多向分化生物学特性[4]。

2 hAMSCs促进创面愈合的机制

2.1 减轻炎症反应：创面愈合大致经历炎症期、增殖期和组织重塑期3个阶段。炎症是机体组织对损伤或致病因子侵入的基本反应，有清除异物及自身伤亡细胞及坏死组织的作用，炎症反应同时也激活释放炎症介质，造成组织损伤及创面延时愈合。有研究表明损伤组织和炎性细胞释放的炎症因子和趋化因子有促进内、外源性MSCs向创面迁移的作用，如CCL5、CCL20、CXCL3等趋化因子及IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF、γ干扰素等炎性因子增多可使MSCs表面趋化因子及炎症因子相关受体表达上调，促使MSCs迁移到创面，参与免疫调节[6]。MSCs的免疫调节功能表现在，如促炎因子激活MSCs，使其旁分泌前列腺素E2、TNF-α刺激基因/蛋白6、斯钙素-1（STC-1）、IL-8 、可溶性人类白细胞抗原G5（sHLA-G5）、吲哚胺二氧化酶（IDO）等，这些因子可抑制中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞的迁移、趋化及树突状细胞的成熟，减少自然杀伤细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖活化；转化生长因子β（TGF-β）及前列腺素-E2（PGE2）可促进MSCs上调抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13的表达和下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、γ干扰素等的表达，减轻炎性介质反应[7]；MSCs能分泌大量巨噬细胞炎性蛋白MIP-1、MIP-2、单核细胞趋化蛋白MCP-5等，选择性募集单核细胞到伤口，减轻炎性介质反应[8]；MSCs分泌PGE2、IDO、sHLA-G5、肝细胞生长因子（HGF）等促进创面从炎症期过渡到肉芽组织形成及组织重塑阶段；MSCs与巨噬细胞相互作用，使促炎Ⅰ型巨噬细胞型转变到抗炎Ⅱ型巨噬细胞。

2.2 促进肉芽组织沉积：成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，在创面愈合与组织修复中起着十分重要的作用。MSCs可促进成纤维细胞的增殖、迁移及抑制凋亡[7]，如：MSCs通过旁分泌纤维细胞生长因子等使成纤维细胞向伤口迁移、增殖、合成及分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，修复创面[9]。ASC-CM可通过上调I 、III型胶原蛋白及纤维连接蛋白，下调基质金属蛋白酶1（MMP-1）mRNA的表达，增加成纤维细胞分泌I型胶原蛋白及向创面迁移[10]。正常皮肤中以I型胶原为主，在创面愈合早期III型胶原表达显著增加，提示III型胶原在创面愈合中有重要作用，有研究表明，III型胶原为MSCs所产生[11]。研究表明，MSCs分泌金属蛋白酶抑制相关因子（TIMP）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子（IGF）等细胞外基质重塑相关因子，TIMP的作用尤为关键。在炎症期炎性细胞分泌大量MMP，在重塑期MMP的过度激活导致MMP与其抑制剂失衡，严重影响胶原合成，致创面经久不愈，MSCs能分泌大量TIMP，恢复MMP与其抑制剂间的平衡[12]。

2.3 促进再上皮化：在创面修复过程中，表皮角质形成细胞迁移、增殖及分化形成新的表皮层覆盖创面。Azari等[13]采用MSCs治疗全层皮肤缺损创面，发现创面可到达完全再上皮化，且炎症反应轻、肉芽组织薄、瘢痕减轻；有实验观察到MSCs可促进表皮细胞向创面中央迁移，且对MSCs移植后的愈合组织进行免疫荧光染色，发现MSCs表达CK19，表明MSCs可分化为表皮细胞而促进创面的再上皮化[14]；MSCs在创面局部可增生分化为多种创面修复所需类型皮肤细胞，如：角质形成细胞、内皮细胞、外周血管壁细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、汗腺细胞等，促进皮肤创面愈合及毛囊、皮脂腺等皮肤附属器的再生与重建[15-16]；Aoki等发现在MSCs、皮下脂肪前体细胞、成纤维细胞的胶原基质上接种角质形成细胞，3种胶原基质均可促进角质形成细胞成活，但只有MSCs能促进表皮网状嵴样结构形成，并延伸到基质内[8]；有实验研究显示MSCs分泌的IL-6、IL-8、血小板生长因子（PDGF）、上皮细胞生长因子（EGF）、角质细胞生长因子（KGF）及bFGF等在皮肤创面愈合及组织再生方面起到重要调节作用[5]；Velander等[17]发现自体成纤维细胞可促进新生上皮形成。

2.4 促血管生成的机制：血管生成是促进创面愈合的关键，创面愈合需要氧气和营养成分，创面肉芽组织内新生血管血液能为创面愈合提供条件。虽然MSCs促进血管生成的机制尚未完全阐明，但已有研究证实MSCs能表达和旁分泌血管内皮生长因子（VEGF）、色素上皮衍生因子（PEDF）、FGF2、胰岛素样生长因子（IGF）、肝细胞生长因子（HGF）、TGF-β、IL-6、EGF、血管性假血友病因子（vWF）、干细胞因子（SCF）、促红细胞生成素（EPO）和血管生成素（ANG）-1等促血管生成的细胞因子或蛋白，促进血管内皮细胞增殖、创面血管新生，增加血管密度。如VEGF可延长内皮细胞的寿命，并诱导内皮细胞增殖、分化、生长和迁移，诱导血管发生、增强血管通透性等。复杂创面组织一般存在缺氧问题，而缺氧条件下更能诱导MSCs分泌这些因子。MSCs也能诱导血管内皮祖细胞（EPCs）增殖、迁移、分化及归巢，促进血管新生及组织再生。因此，hAMSCs能通过促血管生成、丰富创面血运而促进创面愈合[18-19]。

3 hAMSCs的旁分泌

创面愈合是一个错综复杂的生物学过程，涉及炎症反应、细胞增殖、迁移、上皮化、血管生成、细胞外基质沉积等多个方面。MSCs的旁分泌有免疫调节、抑制细胞凋亡、血管发生、化学趋化、抗瘢痕等作用，改善机体局部微环境，促内、外源性MSCs增殖、迁移及分化，挽救濒临凋亡细胞，协调细胞与细胞或细胞与基质间的相互作用，促进多种细胞参与创面修复及组织重建。MSCs分泌多种细胞外基质、细胞因子、生长因子及生物活性蛋白与多种细胞及ECM相互作用，有序调控皮肤组织修复及创面愈合[20]；在MSCs的培养液中可检测到较高水平的EGF、HGF等细胞生长因子，其中EGF有促进细胞增殖、表皮再生、血管形成的作用，也有刺激表皮细胞合成分泌透明质酸、胶原等细胞外基质作用，对结缔组织细胞的生长也起到促进作用；缺氧是影响创面愈合的一个重要因素，MSCs能在缺氧条件下分泌多种因子促进创面愈合，如VEGF促进肉芽组织生长和新生血管形成。

在损伤组织修复的炎症期及增殖期，MSCs发挥免疫调节作用，减轻炎症反应；MSCs分泌特性因子促进创面血管生成和刺激创周MSCs和创面修复细胞增殖、分化、迁移和分泌胶原蛋白，加快创面修复；促进巨噬细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞组成肉芽组织填补创面，并逐渐上皮化。重塑期，创面愈合质量不佳可致瘢痕过度增生，缺乏组织再生修复，瘢痕部位缺少毛囊、汗腺、神经末梢，存在皮肤弹性差、增生瘢痕瘙痒及破溃、活动受限等诸多问题，影响外观及功能，给患者生活带来巨大负担。因此，瘢痕问题也应引起重视，而MSCs有重要的抗瘢痕作用。炎症反应不仅造成组织损伤，炎性介质也引起过量的细胞外基质沉积和纤维化，MSCs可通过调节炎症反应来减少瘢痕形成，有实验研究表明局部注射MSCs可有效减少瘢痕形成[21]；机体损伤时，内、外源性MSCs可分化为内皮细胞、纤维细胞及表皮细胞等，参与皮肤组织再生修复重建，减少瘢痕增生；MSC通过旁分泌抗瘢痕蛋白和促凋亡因子等实现创面的塑形改造[22]，如：HGF可降低TGF-β及胶原的产生，减少纤维化；MSCs分泌TGF-β3、α2干扰素等抗瘢痕蛋白，调控创面中I、Ⅲ型胶原的比例，上调细胞外基质Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤连蛋白的mRNA水平及下调基质金属蛋白酶-9（ MMP-9）的mRNA水平表达，维持细胞外基质环境平衡；通过旁分泌促细胞凋亡的因子等促进瘢痕组织中过度增殖的纤维蛋白原（Fb）发生凋亡，实现创面瘢痕的塑形改造[23-24]。

4 hAMSCs在皮瓣移植中的作用

皮瓣移植修复创面在烧伤整形外科、创伤外科等科室中较为常见，皮瓣移植修复创面可获得理想效果，但皮瓣缺血坏死是常见并发症，主要原因是未能及时重建血运，皮瓣缺血、缺氧及缺血再灌注损伤等。MSCs治疗能改善微循环，减轻缺血再灌注损伤，促进早期血管化，是提高皮瓣移植手术成功的重要方法之一[19]。血管新生的发生机制主要有血管形成和血管生成，血管形成主要依靠内皮细胞的增殖、迁移及重塑完成，以出芽方式从血管床长出，形成新的毛细血管网；血管生成主要由血管内皮祖细胞迁移、分化及重塑来实现[25]。

以往皮瓣移植关注的重点是皮瓣的存活，忽视了皮瓣的感觉功能重建，随着皮瓣移植技术的发展，患者对感觉功能恢复要求的增高，带神经的皮瓣移植术在临床逐渐被推广应用。部分皮瓣移植术中存在神经损伤或需吻合神经，由于神经的损伤，皮瓣移植术后感觉功能恢复不一定能到达理想效果[17]。MSCs可分泌神经营养因子等生物活性物质营养损伤神经，还有合成释放神经递质的神经生物学功能[26]；对hAMSCs进行流式细胞仪检测，发现神经干细胞的特异性标志巢蛋白和CD133，不同程度表达成熟神经元特异性标记髓鞘碱性蛋白、酪氨酸羟化酶和神经元特异性核蛋白。hAMSCs中存在某些神经元细胞表达相关标志，如巢蛋白、β微管蛋白Ⅲ、中分子量神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白等，表明其具有神经细胞和神经前体细胞的生物学特性[27]；hAMSCs通过旁分泌多种细胞因子和抗炎因子调节改善损伤微环境，减轻神经损伤；神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）作为神经系统内的重要神经细胞生长调节因子及神经营养因子，对神经元的发育、再生、分化等有重要作用，轴突生长抑制因子（Nogo-A）可抑轴突再生，促进生长锥塌陷及胶质瘢痕形成，hAMSCs移植可上调受损神经组织内NGFmRNA、BDNFmRNA的表达，下调Nogo-A mRNA的表达，促进神经损伤后的功能修复[28]；同时发挥免疫调节功能，减轻神经组织的免疫损伤[29]。已有研究者应用MSCs移植治疗神经系统退行性及损伤性疾病，并取得了一定效果，其具有广阔的应用前景[30]。

5 展望

hAMSCs符合国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy，ISCT）关于MSCs的定义，与BMSCs具有相似的表型特征，一般参考BMSCs的表面标志物及MSCs的多向分化潜能来鉴定hAMSCs。hAMSC具有扩增能力强、来源充足、低免疫原性、无致瘤性及基本不涉及伦理问题等优点。近年来，有细胞移植研究者用其来治疗多种疾病，并取得了较好的研究成果。

创面愈合过程涉及细胞迁移、增殖、细胞外基质沉积及组织重塑，创面修复是指根据创面不同阶段特点给予人为干预，以便缩短创面愈合时间及改善创面愈合质量。hAMSCs移植通过免疫调节、抑制细胞凋亡、血管发生、化学趋化、抗瘢痕等作用，促进创面修复。hAMSCs移植到宿主体内后分泌特定的细胞因子，调节并激活机体固有MSCs增殖、迁移、分化，移植的hAMSCs也归巢到宿主受损部位，定向增殖、分化为病变部位的组织细胞，参与创面的再生修复，预防瘢痕增生，促进皮瓣存活及神经功能重建。hAMSCs的诸多生物学特性在再生医学领域中具有良好的应用前景，但其在宿主体内存活、迁移、分化及参与宿主器官结构、功能整合的机制仍需进一步的研究，移植到体内后的转归、安全性及使用方法也需继续探索。随着hAMSCs分离、纯化等技术的成熟，分子生物学及细胞生物学研究的不断深入，其移植治疗机制的逐渐阐明，hAMSCs有希望成为细胞移植和再生医学疗法的理想材料。

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[收稿日期]2014-09-17 [修回日期]2014-10-13

编辑/李阳利