水稻玂sGL12基因反义表达载体的构建

黄丹莹　叶能辉　庄楚雄

摘要应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增水稻OsGL12基因反义片段及基因自身的启动子，并分别克隆到 pUC19克隆载体上，得到含有OsGL12启动子+OsGL12反义片段的中间载体。对重组子进行PCR检测和酶切分析并测序，结果表明，长度分别为417和2 199 bp。将OsGL12启动子+OsGL12反义片段克隆到植物表达载体pCambia1380多克隆位点，构建了该基因的植物反义表达载体pCamGL12。

关键词水稻；GL12；启动子；反义表达载体

中图分类号Q782文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12818-03

AbstractOsGL12 antisense fragment and its promoter were amplified by PCR technique and cloned into the same pUC19 clone vector. The recombinant clones were detected by both PCR technique and restriction enzymes. The OsGL12 antisense fragment and promoter were sequenced. Results showed that the lengths of the both DNA fragments were 417 bp and 2199 bp， respectively. The OsGL12 promoter +OsGL12 antisense fragment from intermediate vector pUC19 was cut off and cloned into the multiple cloning sites of the plant expression vector pCambia1380， which can be used as antisense expression vector pCamGL12 for downregulation of OsGL12 gene.

Key wordsOryza sativa L； GL12； Promoter； Antisense expression vector

角质层是覆盖在陆生植物暴露于地面部分的一种疏水的屏障，主要作用是防止水份的丢失，避免紫外线辐射，降低尘埃、花粉和污染物的沉积[1]。角质层主要结构是蜡质，GL1是有关植物蜡质生物合成的基因，研究表明，在玉米、拟南芥中该基因突变能引起角质层蜡质组成的相应改变[2]；GL1在水稻基因组中存在11 个基因位点，命名为 OsGL11OsGL111，已克隆了3个OsGL1基因[3]，但对于OsGL1基因家族在水稻中的生物学功能尚有很多不清楚。

反义RNA技术是一种调控基因表达的有效技术，已在植物基因工程研究中得到了广泛应用。通过互补的反义RNA附加到靶RNA链阻断分子的功能，从复制、转录和翻译水平上控制基因的表达和参与基因表达的调控，削弱相应内源目的基因的表达，即产生所谓“下降性调节”[4]。笔者通过构建反义RNA载体，可用于之后的农杆菌介导转化水稻，观测OsGL12基因由于部分表达受到抑制而产生的表型变化，推测研究OsGL12基因的功能，在抗逆角度上对进一步研究和改善水稻的生物学性状具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料。粳稻品种中花11（ZH11），在华南农业大学网室内栽培。取水稻叶片为材料经液氮速冻后，于-70 ℃冰箱保存。

1.1.2载体与菌株。pUC19质粒克隆载体、转化载体pCAMBIA1380、大肠杆菌菌株E.Coli.DH5α，均由华南农业大学遗传工程实验室收藏。

1.1.3主要试剂与酶。

Amp、Kan、Xgal、IPTG、CTAB，SIGMA公司；DEPC及MOPS，AMRESCO公司；低熔点琼脂糖，BIORAD公司；TRIzolTM，Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、限制性内切酶及连接酶，Takara公司；其余试剂均为国产分析纯产品。

采用TRIZOL法[5]提取水稻总RNA，反转录获得水稻cDNA，作为OsGL12基因片段的扩增模板。扩增体系按照Takara试剂盒要求进行。

OsGL12基因反向片段PCR扩增反应，参数为94 ℃变性2 min 后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，5个循环，再进行 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，28个循环，最后68 ℃延伸10 min。

采用CTAB法[6]抽提水稻基因组DNA，作为启动子克隆扩增模板。启动子片断PCR扩增反应条件：94 ℃变性2 min 后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，反应5个循环，再进行 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，反應28个循环，最后68 ℃延伸10 min。

1.2.2克隆载体的构建。

OsGL12基因启动子PCR产物用凝胶试剂盒纯化回收，随后用EcoRI/KpnI双酶切之后，在连接酶作用下连接到克隆载体pUC19质粒上。热激法制备感受态细胞[5]。将连接产物电激转化E.Coli.DH5α感受态细胞，电激后的菌体培养于1 ml SOC中（200 r/min，37 ℃），1 h后取适量菌液均匀涂布在LB固体培养基（含Amp100 μg/μl）上进行蓝白斑筛选[6]。挑取白色单菌落，于LB液体培养基过夜培养，碱裂解法抽提质粒DNA双酶切检测，用M13系列通用引物对正确重组子进行测序。用引物FP1和RP1扩增的OsGL12基因反向片段，用KpnI/BamHI双酶切后组装到带有启动子的pUC19克隆载体的下游，检测方法同“1.2.1”。

1.2.3OsGL12反义表达载体组装及克隆。

用EcoR I/BamH I将启动子+反义片段从pUC19载体上切下，与pCAMBIA 1380多克隆位点相连，组装成反义表达载体pCamGL12（图1）。电击转化E.Coli.DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定，得到重组子。

3讨论

3.1克隆载体和表达载体的选择

pUC19是一种常用的高拷贝克隆载体，含有LacZ基因，重组pUC19的克隆转化细胞在含有IPTG和XGal的培养基上培养时，可通过蓝/白法筛选，判断载体中有无DNA片段的插入，适于DNA片段的克隆、测序、对外源基因进行表达等。该研究首次采用pUC19为骨架构建中间载体。选用的植物表达载体pCAMBIA1380 质粒是双元载体，含有潮霉素抗性基因和细菌卡那霉素抗性基因，能分别在细菌和植物中复制，适合在植物中表达。

3.2合适的启动子选择

在植物反义表达载体中广泛应用组成型启动子，如CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子等。组成型启动子控制下外源基因在植物所有部位和所有发育阶段都会表达，但外源基因在受体植物内持续、高效表达，不但造成浪费，往往还会导致基因表达的时空特异性改变。目前，特异表达启动子的研究和应用越来越受到人们的重视，自身的启动子可以与基因表达保持同步，能在植物中特异性地表达外源基因，提高反义抑制的效率[7]。该研究将克隆自水稻OsGL12基因以相反的方向插入到其特异启动子下游，目的是使细胞合成特异性的与其目标基因的转录物互补的反义RNA，使基因表达受到抑制。

3.3反义片段长度的选择

反义RNA链的长度对抑制基因的效果有很大影响。在植物中，覆盖整个cDNA的反义RNA能够有效地抑制基因表达。然而，如果受抑制的基因是与发育有关的重要基因，完全的抑制会致死。反义RNA只要与靶mRNA的一小部分（<100碱基）结合即可达到调节作用，说明反义RNA 在发挥作用时并不要求序列的完全互补。反义片段的长度对抑制基因的效果没有固定的规则，覆盖全长或部分正义基因都能够达到调节作用。该研究只采用约0.4 kb的反义序列，抑制基因表达的效果有待进一步做遗传转化试验。

参考文献

[1] POSTBEITTENMILLER D.Biochemistry and molecular biology of wax production in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996，47：405-430.

[2] BIANCHI A，BIANCHI G，AVATO P，et al.Biosynthetic pathways of epicuticular wax of maize as assessed by mutation，light，plant age and inhibitor studies[J].Maydica，1985，30：179-198

[3] ISLAM M A，DU H，NING J，et al.Characterization of Glossy l--homologous genes in rice involved in leaf w ax accumulation and drought resistance[J].Plant Mol Biol，2009，70：443-456

[4] 张学文，罗泽民.拟南芥同源转换盒基因A21反义RNA基因重组体的构建及转化[J].湖南师范大学自然科学学报，2001，24（1）：79-81.

[5] MASON H S，LAM D M K，AMTZEN C J.Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants[J].Proc Nail Acad Sci USA，1992，89：11745-11749.

[6] J·薩姆布鲁克，D·W·拉塞尔.分子克隆实验指南[M ].黄培堂，等，译.3版.北京：科学出版社，2001.

[7] 吴晓梅，朴学成，陈明训，等.白菜型油菜B rDAD1基因的克隆及其植物反义载体的构建[J].河南农业科学，2010（5）：35-39.