APP下载

松江湿地沉积物细菌T—RFLP分析中PCR体系的建立与优化

2014-04-29李莹臧淑英马大龙鄂立思

生命科学研究 2014年4期
关键词:松江条带沉积物

李莹 臧淑英 马大龙 鄂立思

松江湿地为松花江河漫滩地,地势平缓,依托松花江呈东西向带状分布,包括松花江滩涂湿地和支流河口湿地在内的广阔湿地资源,是全国面积最大的原生态城市湿地。湿地内植物区系组成多样,生物多样性丰富,是黑龙江省哈尔滨市重点保护、开发、建设的生态文明区,也是近年来较重视的生态研究区。微生物是湿地生态系统的重要组成部分,在湿地养分的生物地球化学循环中往往起着核心作用,湿地沉积物中的微生物以细菌为主,细菌能参与湿地污染物和有毒物质的降解过程,有助于保持湿地生态系统的平衡和提高湿地自净能力。松江湿地的内部环境和结构较复杂,沉积物中蕴含着丰富的微生物资源,其细菌组成结构能良好地反应湿地环境因子的变化,深层次理解松江湿地生态系统结构和功能,而建立优化PCR体系是利用T-RFLP技术分析微生物资源的前提条件。

末端限制性片段长度多态性(terminal restric-tion fragment length polymorphism, T-RFLP),又称为16S rRNA基因的末端限制性片段(terminal re-striction fragment,TRF)分析技术,是建立在PCR基础之上研究微生物多样性的一种新兴分子生物学研究方法,不依赖于培养即可对微生物进行群落结构分析,具有非常广阔的应用前景。T-RFLP技术具有快速、高度的可重复性、良好的可操作性和产生大量的可操作单元(OTUs),能够与数据库建立直接联系,用于微生物菌种鉴定、群落的对比和多样性分析。本研究对在松江湿地沉积物细菌T-RFLP分析过程中,PCR扩增体系的相关影响因素进行优化和筛选,建立适于湿地沉积物的简单、高效和稳定的PCR反应体系,为进一步开展沉积物细菌群落结构研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

沉积物于2012年8月采自松江湿地哈尔滨段,采集深度为0~20cm,将沉积物用无菌塑料袋密封带回实验室,-20℃冷藏。

PCR试剂所用试剂Taq酶、Mg2+、dNTPs和标准相对分子质量Marker(简写为M) DL2000均购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司,引物由上海生物工程有限责任公司合成。

1.2试验方法

DNA提取及检测:采用MOBIO土壤微生物DNA强力提取试剂盒对0.25g沉积物进行微生物总DNA提取,具体方法按照制造商的说明使用,所提取的DNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测其纯度。

PCR扩增程序与正交试验设计:采用细菌16S rRNA基因通用引物8F(5'-AGAGTTTGATC-CTTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3')进行PCR扩增,正向引物8F用6-FAM(羧基荧光素)标记在5'的末端。

PCR扩增程序如下:95℃预变性5min, 95℃变性30s,56℃复性30s,72℃延伸1min,循环34次。最后72℃延伸7min,4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳缓冲液为lxTAE,205V稳压电泳8min,在紫外光成像系统下照相并记录分析。

在进行单因子试验分析影响因素之后,为快速准确地确定PCR最优反应体系,采用L16(45)正交设计,对PCR 5个因素(模板DNA、Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物)在4个水平上进行试验,20μL扩增反应体系(见表1)。

2结果与分析

2.1单因子试验与分析

2.1.1模板DNA含量

模板DNA的浓度与纯度是PCR是否成功的关键因素之一,DNA含量过高,会结合Mg2+,降低Taq酶的活性,产生非特异性扩增;DNA含量过少,PCR产物少且不稳定甚至无扩增。由图1电泳结果可知,DNA含量在l0~40ng之间均可扩增出条带,DNA含量在10ng时条带弱且不清晰,增加到20~40ng时条带均亮,所以选择20~40ngDNA含量为最佳。

2.1.2Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的产量和特异性有显著的影响,还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物相结合,影响引物与模板的结合效率、模板与PCR产物的解链温度和产物的特异性及引物二聚体的形成。Mg2+浓度过高会降低PCR反应的特异性,出现非特异性产物;浓度过低会抑制Taq酶活性,降低PCR扩增产量。由图2电泳结果可知,Mg2+浓度在2.5mmol/L时条带颜色浅;2.0mmol/L时条带较亮;当降低到1.5、1.0mmol/L时条带逐渐变浅且弥散。因此,Mg2+最佳浓度为2.0mmol/L。

2.1.3dNTPs浓度

dNTPs是PCR扩增反应的原料,其浓度过高时,会导致聚合酶错误的掺入,并引起碱基错配,降低PCR扩增的忠实性;浓度过低时,又会影响合成效率。由图3电泳结果可知,dNTPs在2.5mmol/L时条带模糊小清晰,在2.0~1.0mmol/L之间时,随浓度降低条带逐渐变亮,所以dNTPs浓度选在2.0mmol/L时效果为最佳。

2.1.4引物浓度

引物是PCR特异性反应的关键因素之一,PCR扩增产物的特异性取决于引物与模板DNA结合的程度。引物浓度偏低会减少与模板DNA的结合率,使扩增效果降低;引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,容易增加形成引物二聚体的机会。由图4电泳结果可知,当引物浓度在0.2-0.15μmol/L之间时条带均亮,尤以0.2μmol/L最佳,扩增效果较好,引物浓度降低到0.1μmol/L时条带浅且弥散严重。

2.1.5Taq酶浓度

Taq酶用量偏低会使合成的效率降低,导致扩增产物减少;用量过高不仪造成浪费,而且会导致非特异性片段产物的积累,不易形成良好的扩增效果。从图5电泳结果可知,Taq酶含量在2.0、1.5、1.0、0.5U时条带均亮且明显,但从扩增效果和经济性两方面考虑,Taq酶浓度在0.5U时为最佳选择。

2.2正交试验结果与分析

按表l设计的16个PCR反应组合进行正交试验,扩增结果如图6所示。根据电泳检测结果,将16个处理按扩增条带强弱、背景颜色深浅和条带弥散程度打分。条带清晰亮度大、背景颜色浅、无弥散与特异性条带的最佳效果为16分,相反最差为1分。1~16组合的分数依次是:1、2、8、9、1、l、10、1、2、14、16、15、4、6、13、13。

通过分数求出各列各水平的和,可求知各水平的平均值(见表2)。然后用各列最大平均值减最小平均值求出极差R,极差值越大表示该因素影响程度越大。由极差可知,PCR反应中各因素影响力大小依次为:Mg2+>DNA模板>Taq酶>dNTPs>引物,其中正交试验的最佳反应组合是11号:DNA模板30ng,Mg2+ 2.0mmol/L,dNTPs 0.2mmol/L,引物0.2μmol/L,Taq酶0.5U。

3讨论

松江湿地沉积物细菌结构的组成、分布、变化不仅是其自身生物特征的反映,也是其对周围环境因素的一种响应。由于近年来旅游资源的开发,人为干涉因素增多,松江湿地的环境因素变化较大,其沉积物中的微生物结构也会发生相应改变。T-RELP分析技术是建立在PCR基础之上研究微生物多样性的一种新兴分子生物学研究方法,不依赖于原始培养可较快地对微生物群落结构进行分析。利用T-RELP分析技术对松江湿地沉积物细菌结构进行分析,能更好地反映松江湿地生态系统的现状,而建立一个良好的PCR体系是后续研究的必要基础。

由于T-RELP是建立在PCR基础之上的分子技术,如果对其在DNA提取、PCR扩增等过程中的技术细节不注意,则有可能对T-RFLP分析结果产生误差。DNA提取是PCR扩增反应的前提,其纯度和质量是整个试验的基础和关键,由于试验样品的差异,会使每次提取的DNA纯度有所不同,从而影响PCR反应体系的建立。另外,由于基因组DNA相对分子质量较大,在DNA提取过程中会因动作剧烈、枪头空间小等原因使基因片段发生断裂,因此,为获得完整的DNA片段,在试验过程中应尽量避免剧烈震荡。

在PCR扩增程序中,模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶都会不同程度的影响反应结果。其中,Mg2+是Taq DNA聚合酶活性的激活剂,影响酶的活性与忠实性,Mg2+还能与模板和引物结合,从而影响引物与模板的结合效率及引物二聚体的形成。DNA模板含量是PCR扩增反应的关键因素之一,DNA量过高会导致非特异性片段的出现,模板量过低会降低反应效率。dNTPs、引物的质量和浓度与PCR扩增效率也有着密切关系,过低或过高都会影响扩增效率,甚至会阻止反应进行。

试验结果表明,不同的反应体系会对PCR扩增效果产生较大影响,合理的PCR反应条件是进行扩增与后续T-RELP分析的基础。因此,在PCR扩增反应试验过程中运用单因子试验与正交设计进行体系优化,结合正交试验图表结果分析各因素间的相关性,可快速准确地识别出反应中的关键影响因素。与单因素试验相比,正交试验能更标准、快速地找到目标最优化体系,且试验重复少、客观准确性高、代表性强,现已被广泛运用于PCR体系优化试验中。通过单因子试验与正交设计对PCR扩增反应中各因素的比较,确立沉积物细菌T-RFLP分析中PCR反应中最优体系为:DNA模板30ng,Mg2+ 2.0mmol/L, dNTPs 0.2mmol/L,引物0.2μmol/L,Taq酶0.5U。此反应体系重复性好、稳定性强,可较好地应用到后续的T-RELP分析中,为今后开展松江湿地沉积物微生物的相关研究奠定了良好基础。

猜你喜欢

松江条带沉积物
晚更新世以来南黄海陆架沉积物源分析
渤海油田某FPSO污水舱沉积物的分散处理
水体表层沉积物对磷的吸收及释放研究进展
启航
——松江二中(集团)初级中学校歌
基于条带模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的双基成像算法
讨论用ICP-AES测定土壤和沉积物时钛对钴的干扰
基于 Savitzky-Golay 加权拟合的红外图像非均匀性条带校正方法
骑马到松江
一种基于MATLAB的声呐条带图像自动拼接算法
淄师学人
———王松江