海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析

徐靖 王效宁 韩义胜 熊怀阳 严小微

干旱、低温和高盐等非生物胁迫严重影响植物生长发育和作物产量。在长期的进化过程中植物已在分子、细胞和系统水平上进化出了一套复杂的调控机制来感受并响应各种外界刺激，转录因子调节下游基因的表达来应答环境变化是这一调控机制的重要环节。AP2/ERF（apetala2/ethy-lene response factor）家族转录因子含有60～70个氨基酸组成的高度保守AP2结合域，是植物中最大的转录因子之一，通过调节下游基因的表达广泛参与植物的生长发育、激素应答及对生物和非生物胁迫的响应。目前AP2/ERF转录因子已在拟南芥、水稻、玉米、大豆、西红柿、黄瓜等多种植物中得到鉴定。根据DNA结合元件的不同，可将AP2/ERF转录因子分为AP2、ERF、DREB（dehydration-responsive element-binding protein）和RAV（related to ABI3/VPl）4个亚家族，ERF家族是AP2/ERF转录因子大家族的一个主要亚家族，在调节植物对生物和非生物逆境反应中发挥重要作用。

普通野生稻（Oryza rufipogon， Griff）是亚洲栽培稻的祖先，能够长期生长在各种恶劣的自然条件下，具有很强的抗逆特性，是水稻抗逆育种重要的遗传资源。海南普通野生稻最原始，遗传多样性最高，具有很高的开发利用价值。在先前的研究中，筛选获得一批抗逆性较强的海南普通野生稻材料，能够长期在干旱、低温和贫瘠等条件下健康生长。为了进一步了解海南普通野生稻的抗旱机理，对干旱条件下差异表达基因进行了分析，并筛选获得了一个编码AP2/ERF转录因子的基因片段（结果未显示），本文在此基础上对该基因进行克隆和表达分析，为揭示该基因的功能奠定基础。

1材料和方法

1.1材料

将收集的普通野生稻（Oryza rufipogon Griff）种子置于50℃烘箱中干燥48h，打破休眠，用1%的HgCl2消毒10min，清水冲洗4～5次。置于人工气候箱培养，使用国际水稻所营养液进行培养，每5d换一次培养液，长至5叶期时于20%PFG条件下进行模拟干旱处理。150mmol/L NaCl条件下进行盐胁迫处理，4℃光照培养箱中进行低温处理，分别在处理0、2、4、6、12、24、48h取样，用液氮磨成干粉状，-70℃保存备用。

1.2OrERF1基因和启动子的克隆

根据先前筛选获得的AP2/ERF转录因子基因片段，在NCBI数据库中搜索到与它最相似基因的CDNA序列，设计特异引物OsERFIF：5'一AGCGGTCCATGTGCTGTACCGGCGA-3'和OsE-RF1R：5'-TAGGGTTAATCACGATGTGATCCTG一3'。根据OrERFl在水稻基因组中最相似基因的启动子序列设计特异性引物POsERFIF：5'-AACGCACATATGTTCATTGCCTAA一3'和POsE-RF1R：5'-GCCACCTCGTCGCCGGTACAGCACA-T-3'，分别以海南普通野生稻cDNA和基因组DNA为模板，对OrERF1的cDNA序列和启动子序列进行扩增。PCR扩增反应：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经回收和纯化后，与pMD-18T Cloning Kit （TAKARA公司）连接。将连接产物转至DH5a感受态细胞，通过PCR检测确定阳性克隆，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

1.3生物学信息学分析

用ORF finder分析OrERFl cDNA序列的开放阅读框，蛋白质序列分析在http：//www.expasy.org网站相关软件完成：通过BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）与GenBank中登记的序列进行同源性比较，用DNAMAN软件对氨基酸序列进行比对，并构建系统发育树；利用启动子顺式作用元件预测网站PLACE软件（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）对OrERF1启动子序列进行分析。

1.4OrERF1的表达分析

采用北京康为世纪生物科技有限公司的SYBR green RT-PCR one step kit及Mx3005PPCR仪进行基因表达水平检测。目的基因引物为QOrERFIF：5'-CTCAGTACGCGAGGTTCTTG-3'和QOrERFIR：5'-GAAGCTGTAGAGCACJTGTA-GTG-3'；内参引物为18S，其引物为18S F：5'一CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3'和18S R：5'-CG-AACACTTCACCGGATCATT-3'。PCR程序为95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；按默认程序绘制55℃至95℃融解曲线，不同处理条件下Oh的样品设为Calibrator进行相对表达定量分析。

2结果与分析

2.1OrERFl的克隆和分子特征

根据OrERF1在水稻基因组中的相似序列设计特异引物，以海南普通野生稻cDNA为模板进行PCR扩增，获得一个1044bp的基因序列，包含一个1014bp的完整阅读框，编码337个氨基酸。OrERF1基因编码氨基酸的相对分子质量为34.70kD，理论等电点为5.30。

生物信息学分析表明OrERFl具有典型的植物AP2/ERF类转录因子结构特征，包含一个由63个氨基酸组成的AP2保守结构域（划线处）（图1）。OrERFl与籼稻中所对应的蛋白同源性为98.53%，涉及3个氨基酸的变异，1个氨基酸的缺失；与粳稻所对应的蛋白同源性为98.82%，涉及1个氨基酸的变异，3个氨基酸的插入；与大麦（Hordeum， vulgare）、玉米（Zea mays）和橙子（Citrussinensis）中的相应蛋白的同源性分别为50.71%、50.56%和39.89%。

2.2蛋白序列系统进化分析

AP2/ERF类转录因子根据DNA结合域的特点可分为AP2、ERF、DREB和RAV 4个亚家族，为了进一步确定OrERFl与AP2/ERF类转录因子之间的进化关系，选取了水稻中不同亚家族AP2/ERF类转录因子与OrERFl进行同源比对，构建系统进化树.结果显示水稻AP2/ERF类转录因子分为4个分支，OrERFl与ERF亚家族聚为一类（图2），说明OrERFl是ERF类转录因子。

2.3OrERF1启动子的克隆和序列分析

根据OrERF1在水稻基因组中最相似基因的启动子序列设计特异性引物，以海南普通野生稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得OrERFl基因翻译起始密码子ATG上游1358bp的启动子区域。对OrERF1启动子序列进行预测分析发现，该序列具有真核生物典型启动子结构特征，核心启动子区位于ATG上游-112～-52bp，其可能的转录起始位点位于翻译起始位点上游-61bp处；OrERF1启动子区还含有众多应答激素和胁迫信号元件，如茉莉酸应答元件CGTCA-motif、水杨酸应答元件TCA-element、真菌应答元件Box-Wl、厌氧应答元件ARE （anaerobic response ele-ment）、盐诱导元件GT-1 motif、低温应答元件LTR （low temperature responsive）和干旱应答相关元件MBS和ACGTATERD1等（图3）。

2.4OrERF1表达分析

利用实时荧光定量PCR检测了OrREFl在模拟干旱（PEG）、盐（NaCl）和低温（LT）等逆境条件下的表达特征。结果显示，3种处理均能显著上调OrREFl的表达。在PEG和NaCl处理后，OrREF1具有类似的表达特征，早期变化并不明显，在处理12h后显著增加，达到最大值；OrREFl对低温比较敏感，处理后2h OrREF1的表达量就显著上调，12h时达到最大值，48h时仍维持较高水平（图4）。

3讨论

大量的研究表明ERF蛋白在抵御病原体侵害的防御响应中具有重要的功能，过表达ERF基因能够诱导下游PR相关基因的表达，增强植株对病原体的抗性。近年来研究表明，ERF蛋白不仅在病原防御响应中起重要作用，在激素和非生物胁迫响应中也具有重要的功能。例如，大豆GmERF3和GmERF7受干旱、高盐和低温等多种非生物胁迫的诱导，过表达后能够提高烟草的抗盐性、抗旱性和抗病性；水稻OsDERFl受干旱、乙烯和脱落酸调节，过表达后能显著减低水稻对干旱的耐受性。虽然大量的ERF基因在不同植物中得到克隆，但只有少部分ERF基因在非生物响应中的功能得到鉴定。

普通野生稻蕴藏着丰富的抗逆基因，是水稻抗逆育种的重要遗传资源。普通野生水稻驯化成栽培稻的过程中，一些基因会发生变异甚至丢失，这可能是普通野生水稻具有更强的抗逆性的原因。本研究在海南普通野生稻中筛选获得一个受干旱诱导表达的ERF类转录因子OrERF1，编码的蛋白有337个氨基酸组成，该基因在栽培稻的同源基因是一个未知功能基因，与栽培稻中的同源蛋白有4个氨基酸的差异。初步确定该基因是一个多逆境应答基因，OrERF1除了受干旱诱导外，也能对低温和盐胁迫做出响应。

植物基因启动子含有多种重要的顺式作用元件，在转录水平上通过与转录因子的协调作用，参与调控下游基因的表达，从而使植物能够对各种生物和非生物胁迫做出响应。OrERFl启动子区含有真菌应答元件Box-W、厌氧应答元件ARE、低温应答元件LTR和干旱应答元件MBS等生物和非生物胁迫元件。这进一步说明OrERFl在野生稻的逆境胁迫响应中扮演重要角色。下一步将构建OrERFl的植物表达载体，通过转化水稻和拟南芥对其功能做进一步的验证。