THP—1分化的巨噬细胞来源Exosomes的生物学特征鉴定

王建军 姚永良 陈偲 吴建红 赵淑玲 汤立军

摘要：利用佛波酯体外分化人急性单核白血病细胞形成巨噬细胞，并用低温超速离心法从巨噬细胞培养上清收集Exosomes，并分析其生物学特征。Exosomes经透射电显微镜分析形态，并用Western blot方法分析Exosomes膜上特异性蛋白CD80、ICAM-3、HSP-70的表达对其生物学特征进行鉴定。研究结果表明佛波酯成功诱导人急性单核白血病细胞分化成人巨噬细胞。获得的巨噬细胞分泌微小囊泡经透射电镜分析后，微小囊泡的直径在30～100nm，并且其含有Exosomes的特征性蛋白CD80、ICAM-3、HSP-70等蛋白，表明其为Exosomes，使用低温超速离心法成功收集到Exosomes，为后续开展Exosomes的成份及功能分析提供了保障。

关键词：巨噬细胞：Exosomes；透射电镜；超速离心

中图分类号：Q28

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）04-0283-03

Johnstone等研究网织红细胞发育时，发现网织红细胞成熟过程中会分泌出一种囊泡状物质，于是分离纯化了该物质并命名为Exosomes。目前研究认为Exosomes由细胞内多泡体（muiti-vesicular body， MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～100nm的膜性囊泡，这些小囊泡具有呈递生物相关抗原与免疫治疗作用的特性。

巨噬细胞是目前功能最强的抗原呈递细胞，能刺激初始型T细胞增殖，激发机体免疫应答。巨噬细胞分泌的Exosomes主要表达MHC分子、共刺激分子及特异性抗原肽，并能将抗原刺激信号运送到抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APC）或T淋巴细胞从而诱导特异性免疫应答，发挥重要的免疫调节作用。近些年来Exosomes在免疫调节、肿瘤治疗、疫苗开发等方面的作用已经引起科研人员的极大关注并已经展开了许多基础与临床研究。

但由于Exosomes直径一般在30～100nm内，很难从细胞上清中分离及获得纯度较高的Exo-somes。本文主要利用低温超速离心方法收集巨噬细胞分泌的Exosomes，并对其形态学与生物学特性进行初步的分析鉴定，为后续实验研究奠定了实验技术基础。

1材料与方法

1.1材料

人单核白血病细胞系THP-1来自武汉大学保藏中心。

1.2试剂及仪器

RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hy-clone公司，CD80、ICAM-3、HSP-70抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司、佛波酯（12-邻-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯，PMA）购自德国默克公司，Cocktail蛋白酶抑制剂购自长沙海扬生物技术公司、蔗糖、磷钨酸均购白南京金斯瑞生物技术公司。

美国Beckman超速离心机；日本日立透射电子显微镜；美国Forma Scientific CO2细胞培养箱；倒置显微镜（Olympas）；中国六一垂直电泳仪。

1.3 细胞培养

THP—l细胞于含10%胎牛血清的RPMl-1640培养基中，37℃，5% CO2饱和湿度环境中培养48h后，0.1mmol/L PMA诱导THP-1细胞24h，使其分化形成巨噬细胞。

1.4Exosomes收集

收集巨噬细胞上清液，4℃，4000r/min，离心20min，保留上清；4℃，10000r/min，离心45min，保留上清；4℃，32000r/min，离心60min，保留沉淀，9%蔗糖溶液200μL、lOOx蛋白酶抑制剂2μL溶解沉淀；4℃，40000r/min，离心45min保留沉淀，9%蔗糖溶液50μL、lOOx蛋白酶抑制剂lμL溶解沉淀，-80℃保存备用。

1.5Exosome透射电镜鉴定

取10μL新鲜Exosomes溶液，3%磷钨酸染色5min，将Exosomes滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察其形态大小并拍照保存分析Exo-somes提纯质量。

1.6Western blot

Bradford方法测定Exosomes蛋白浓度；配制10%SDS-PAGE电泳凝胶，将变性后的蛋白质按50μg的蛋白质总量上样电泳，然后通过电转移法将蛋白质转至PVDF膜上，以免抗人CD80、I—CAM-3、HSP-70抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的二抗进行免疫反应，凝胶成像系统观察拍照。

2结果

2.1佛波酯（PMA）诱导THP-1分化成巨噬细胞

THP-1细胞培养48h后细胞密集度达80%后的生长情况，THP-1细胞经0.1mmol/LPMA诱导24h后，分化形成梭形巨噬细胞（图1），分化形成的类巨噬细胞具很强的吞噬功能。

2.2透射电镜鉴定Exosomes

10μL新鲜Exosomes溶液，与3%磷钨酸2μl染色5min后，Exosomes溶液轻轻滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察Exosomes形态学特征（图2A），并利用NanoSight统计系统分析Exosomes溶液中囊泡直径大小，并绘制曲线（图2B）。

2.3Exosomes膜蛋白表达

CD80、ICAM-3和HSP-70 3种蛋白质在不同细胞来源的Exosomes上均有表达，目前认为这3种蛋白质可以作为Exosomes的特征蛋白质。Western blot研究分析巨噬细胞分泌的Exosomes膜上CD80、ICAM-3、HSP-70的表达（图3）。

3讨论

近年来，越来越多的实验结果证明：树突状细胞和肿瘤细胞产生的Exosomes具有显著的免疫调节功能，可转运肿瘤抗原至抗原提呈细胞，诱导细胞毒性T-淋巴细胞反应，产生和增强抗原特异性免疫应答；Exosomes的非细胞性及其不易被体内环境诱导丧失活性、无繁殖能力、稳定性高、体积小易清除、储藏时间长等优点，使Exosomes有可能成为一种很有潜力的新型无细胞治疗性肿瘤疫苗。目前法国科学家研究的树突状来源的Exosomes肿瘤疫苗已经进入临床I期，并且尚未发现任何副作用。Bard等研究报道，肿瘤来源的Exosomes亦可诱导有效免疫应答，如恶性渗出物（胸水、腹水）中的Exosomes同样含有肿瘤抗原和抗原提呈分子，可以诱导产生抗肿瘤一细胞反应。

本研究通过佛波酯PMA在体外诱导人单核白血病细胞分化形成巨噬细胞，并通过超速离心法收集巨噬细胞培养上清中微小囊泡。经透射电镜分析表明收集到的95%的微小囊泡物质的直径在30～100nm范围内，从而证明低温超速多步离心法成功收集获得巨噬细胞分泌的Exosomes，该方法可以应用于大批量Exosomes的收集以满足后续实验Exosomes的需求。

根据蛋白质组学的研究分析，Exosomes蛋白成分可以分为3类：提呈相关蛋白质如热休克蛋白、MHC类分子；信号转导相关蛋白质如整合素、膜联蛋白、四跨膜蛋白家族；细胞骨架蛋门如肌动蛋白、微管蛋白，不同细胞来源的Exosomes的蛋白质有一定差别，而脂质成分与质膜的成分相似。Exosomes介导细胞间信息传递主要通过Exosomes表面蛋白复合体与不同细胞表面受体配对，在细胞之间没有直接接触的情况下进行细胞之间的信号传导。本实验采用Western blot方法分析了巨噬细胞来源Exosomes表面的3种特征性蛋白CD80、ICAM-3、HSP-70的表达，实验再次表明Exosomes的蛋白种类丰富，且不同来源Exosomes的蛋白有一定的共同性。本实验的初步研究为后续大规模收集Exosomes及后续免疫动物实验打下了坚实的技术基础。