儿童呼吸道病毒感染核酸检测的研究进展

唐晓丽

【摘 要】呼吸道感染是儿科最常见的疾病，病毒是引起呼吸道感染最常见的病原 [1]。常见的呼吸道病毒有呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒和腺病毒等。近年来新的致病性病毒也不断地被发现，如人类偏肺病毒、人博卡病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒等。部分病毒传染性强，传播速度快，潜伏期短，临床表现类似，儿科医生无法依据病情准确判断病原，给临床诊断及治疗带来极大困难。精确的病原学分析不仅是临床确诊依据，也对控制传播途径、采取预防措施及合理选择治疗方案非常重要。因此，临床开展准确、快速呼吸道病毒检测已成为儿童呼吸道感染中的重要诊断手段，而基于PCR技术的分子诊断方法就成为呼吸道病毒检测的新标准。

【关键词】呼吸道病毒；病毒检测；分子诊断方法

呼吸道病毒感染传统的诊断方法为病毒分离培养及血清学实验。病毒分离培养是确诊病毒及发现新病毒的重要技术手段，但培养及鉴定过程繁琐，费时，诊断效率低，临床开展有一定困难。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，基于PCR技术的分子诊断方法已成为呼吸道病毒检测的新标准。本文就目前呼吸道病毒核酸检测的研究进展作一总结论述。

1 多重PCR技术

多重PCR技术可在一次反应体系中同时检测和鉴别多种病原体，在混合感染的鉴别诊断上具有很高的实用价值。因其快速、简便和高通量等特点，目前多重PCR技术在呼吸道病毒的检测中已得到了广泛应用。近年出现了一些自动化程度高，操作简单的检测平台，如Seeplex TMRV和Labopass TMRV检测试剂盒。Seeplex TMRV试剂盒在保证高度特异性的同时，具有更大范围的退火适宜温度，Seeplex TMRV-12试剂盒则能够同时检测12种呼吸道病毒。

2 多重实时荧光定量PCR技術

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累，对常规PCR过程进行可视化的实时监测。近年来多重荧光定量PCR技术已成为呼吸道病毒检测的研究热点。该方法具有特异性强、重复性好、实时定量等特点，实现了PCR从定性到定量的飞跃。运用多重荧光定量PCR方法可成功地对流感病毒进行分型，也可同时检测副流感病毒、冠状病毒和呼吸道合胞病毒等多种呼吸道病毒。Sung等应用多重荧光定量PCR方法检测急性呼吸道感染住院患儿呼吸道标本中的病毒，总阳性率为47%，是病毒培养等常规方法检出率的2倍。Chen[2]等用该方法检测流感病毒和呼吸道合胞病毒，发现其检测灵敏度和特异度分别为99%和100%。但PCR方法不能区别有毒力的病毒和死病毒，因此目前尚不能完全代替传统的病毒分离培养。

3 环介导等温扩增技术（LAmP）

环介导等温扩增技术是利用6条特异性引物与靶基因的6个不同区域进行退火杂交和等温扩增。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环及紫外线观察等过程，因此具有简单、快速等特点。利用LAMP技术，还可对甲型流感H1到H3亚型进行分型。因该技术对实验室条件要求不高，故特别适合基层单位进行病原微生物的快速检测。

4 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）

依赖核酸序列的扩增技术是在PCR基础上发展起来的新技术，是由一对带有T7启动子序列的引物引导的连续、等温的核酸扩增技术。可在2h内将模板RNA扩增109倍，比常规PCR高1000倍，因此具有快速、灵敏、特异性强等特点。

5 基因芯片

基因芯片又称基因微阵列，是指将大量靶基因片段固定在经过修饰的载体上，与标记的核酸样品进行杂交，经信号处理系统分析杂交信号，获取样品检测结果。基因芯片技术具有高通量、快速检测等特点，已被广泛应用于多种病毒的检测。利用基因芯片技术，可通过一次检测获取所有病毒信息，包括发现新病毒或变异株。丁丽新[3]等采用基因芯片对180例发病初期的呼吸道感染病人的咽拭子标本进行检测，其结果表明采用基因芯片技术可以在短时间内直接从病人的咽拭子标本中同时检测8种呼吸道病原体。Chiu等建立的病毒芯片可同时检测7种呼吸道病毒，检出效率较免疫荧光法提高了19%，与特异性PCR扩增检测方法相当。但基因芯片的不足之处在于费用高，研制周期长，在临床广泛应用有一定困难。

6 深度测序技术

2005年底，454公司推出了基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统。与传统测序相比，该方法的主要特点是能在极短时间内对生物样品基因组进行分析，可在未知基因组信息的情况下用于直接病毒检测，有助于检测未知病毒和病毒突变株。Yongfeng H[ 4 ]等采用该技术对4位病人咽拭子标本进行检测，在48小时内获得了超过590000个序列，涵盖了几乎全部细菌、真菌、病毒等核酸信息，此外，甲型流感病毒被特异性检出。但测序检测到的病毒序列不足以建立疾病的因果关系，因此在临床应用中还需结合病毒培养及血清学方法共同分析。

7 自动化检测系统

随着分子诊断方法的日益完善，呼吸道病毒的商品化检测技术平台相继问世。FDA于2008年批准可同时检测和鉴定l2种特殊呼吸道病毒的xTAG呼吸道病毒检测板在美国上市。xTAG可同时检测和区别A型流感病毒H1和H3亚型，也可检测2001年才被人类认识和发现的人类偏肺病毒。该试剂盒在2009年流感大流行期间发挥了重要的监测作用。目前最新的xTAG试剂盒可在3.5h内同时检测多达20种病毒及其亚型。ProFlu+是另一种FDA批准的病毒即时检测法，该方法可在3h内完成4种常见呼吸道病毒（A型和B型流感病毒及A型和B型呼吸道合胞病毒）的检测。

BD Max系统是美国BD公司研发的全自动实时定量PCR检测系统，该系统整合了全自动核酸提取和实时荧光定量PCR技术，扩增反应在3h内完成。研究显示该技术对流感病毒和RSV的检测灵敏度和特异度均达到较高水平。Idaho Technologies公司研发的FilmArray分子诊断平台能在1小时内完成从核酸提取到数据分析过程，目前该平台能检测15种常见的呼吸道病毒[5]。

這些自动化的操作系统与传统检测方法相比，能明显缩短检测时间，实现高通量检测，同时避免了实验操作中的人为因素误差，使得检测结果更加均一，是今后病毒检测技术的发展方向所在。

8 小结

呼吸道病毒是呼吸道感染的主要病原，多种病毒的协同感染、病毒的变异和新病毒的出现给人们认识和防控病毒感染带来巨大挑战。在临床工作中，对呼吸道感染病人进行病毒病原的检测能为疾病的临床诊断和治疗提供可靠的病原学依据，防止抗菌药物滥用。此外，长期监测特定地区病毒的流行季节、易感人群及临床表现对疾病的预防、流行病学研究及疫苗的研制均有重要意义。因此了解和掌握呼吸道病毒检测新技术、新方法对疾病的诊断、治疗和疫情的防控非常重要。由于核酸检测方法的灵敏度、特异性都较传统的病毒分离培养、免疫荧光等方法显著提高，目前已成为各实验室主要检测技术。有研究显示，多重PCR检测呼吸道病毒是最节约成本的检测手段，实时荧光定量PCR技术能提供病毒载量的定量信息，有助于进一步研究病毒与临床表现关系，高通量的检测方法及宏基因组技术是目前的发展趋势，而新型核酸扩增技术如NASBA也有很好的发展前景。近年来，分子诊断技术自动化程度不断提高，商品化的自动检测技术大大提高了实验效率，使其更加符合临床需要。在临床工作中，我们可根据自身实验目的及实验条件选择检测技术，为呼吸道感染的病毒病原学诊断提供可靠依据。

参考文献

[1]Mathony J B.Detection of respiratory viruses by molecular methpds[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（4）：716-747.

[2]Chen Y，Perez J W，Vargis e A，et al .Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immune-polymerase chain reaction[J]. Anal Biochem，2011，26（2）：124-126.

[3]丁丽新，吴疆，林长缨.基因芯片技术在常见呼吸道病毒感染早期诊断上的应用[J].国际病毒学杂志，2007，14（4）：105-107.

[4]Yongfeng H， Fan Y， Jie D， et al. Direct pathogen detection from swab samples using a new high throughput sequencing technology[J]. Clin Microbiol Infect，2011，17（2）：241-244.

[5]Poritz M A，Blaschke A J，Byington C L，et al.FilmArray，an automated nested multiplex PCR system for multi-pathogen detection：development and application to respiratory tract infection[J]. Plos One，2011，6（10）：e26047.