诺如病毒检测技术新进展

2014-04-29雷务年

中国保健营养·中旬刊 2014年2期

【中图分类号】R155 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0758-02

诺如病毒（Norovirus NoV）又称诺瓦克病毒（Norwalk-like viruses），属杯状病毒科诺如病毒属，是引起病毒性胃肠炎的重要病原体[1]。NoV是美国学者Kapikian于1972年通过免疫电镜技术首先在发生于美国俄亥俄州诺瓦克镇暴发腹泻疫情患者粪便中发现的病毒颗粒[2]。NoV为单股正链RNA病毒，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。由于目前不能进行细胞培养和没有动物模型不能进行中和试验，NoV目前无法进行经典的血清分型[3-5]。该组病毒极易变异，此后在其他地区又相继发现并命名了多种类似病毒，统称为诺如病毒。由于NoV遗传的高度变异，在同一时期和同一社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行。NoV抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染[6]。大多数感染者在1～3天后好转，但小孩、老人和低免疫力低下者可能导致严重脱水[7]。

诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。1995年，我國报道了首例NoV感染[8]，之后山西、北京、安徽、福州、武汉、广州等地区先后发生多起NoV感染性腹泻暴发疫情，在我国5岁以下腹泻儿童中，NoV检出率为19%左右[9]。以前由于检验技术的滞后使得许多NoV感染病例无法确诊。本文综述NoV检测技术的研究进展，为NoV的防控提供理论支持。

1 电镜法

电镜法包括直接电镜法（EM）、免疫电镜法（IEM）和固相免疫电镜法（SPIEM）。EM法观察的灵敏度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM法比EM法的敏感性可提高100倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。SPIEM法是将特异性抗体直接包被载网，同时加入蛋白A增加抗体与抗原接触的机会，从而增加检出的灵敏度。方肇寅[9]等曾用20份便样上清液滴膜后，2%PTA（pH 6.4）染色直接电镜观察在国内首先发现了诺瓦克样病毒。电镜法的缺陷在于要求观察者有丰富的经验，精密的检测仪器和较大的劳动强度，灵敏度相对较低，检出阳性率只达10-20%，制约了该方法的在NoV检测中的应用[10]，不适于大规模流行病学调查。

2 免疫法

免疫学检测法（EIR）包括放射免疫法（RIA）、生物素-亲和素免疫法（Biotin-Avidin Immun-oassy）、酶联免疫法（ELISA）和免疫层析技术。

2.1 RIA法和生物素-亲和素免疫法

RIA法的灵敏度比IEM法可提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA法的不足之处在于它需要6d，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与RIA法相当，目前该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NoV抗原和抗体的标准实验方法之一。

2.2 ELISA法

1992年Jiang等重组杆状病毒表达NoV衣壳蛋白成功后，建立起的NoV酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。陈冬梅[12]等用日本赠送的NoV检测试剂盒检测粪便中NoV，分别用NoV GGⅠ、GGⅡ特异性单克隆抗体包被微孔板中的不同小孔捕获粪便标本中的NoV抗原，然后用过氧化物酶标记的抗NoV特异性多克隆抗体检测，所以不同的小孔可同时分别检测GGⅠ、GGⅡ型NoV。共检测167份粪便标本，GGⅠ型阳性20份、GGⅡ型阳性19份，GGⅠ型、GGⅡ型同时阳性7份，总阳性率27.5%（46/167）。Moe等开发一种利用NoV的重组抗原检测唾液中特异性IgA和IgG抗体的ELSIA方法。对该法的评估表明其灵敏度和特异性分别达到100%和95%，但上述结果还有待进一步验证。该方法采样方便，提供了一种检测血清抗体之外的新途径[13]。由于NoV培养还未成功，原来用作试剂的病毒抗原数量受到限制，现在，用分子生物学技术已经可以人工重组NoV的衣壳蛋白，从而解决了上述问题。酶联免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，是目前可广泛应用的检测方法。

2.3免疫层析技术

此技术即免疫胶体金技术，是把层析技术和免疫亲和作用相结合的快速检测NoV的方法，操作简单快速、可靠而应用广泛。该方法是采用抗NoV抗原的单克隆抗体，制成试纸条进行检测。Tak-anashia S.等[14]首先于检测NoV病毒的检测，并与RT-PCR法进行比较，结果显示，它们的一致性为84.1%、灵敏度为69.8%、特异性为93.7%，病毒载量检测限为106-107拷贝/g粪便。国外已有多种商用试剂盒供应，目前国内市场上皆为国外产品。

3 分子生物学检测方法

杂交技术和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），自PCR技术创建以来在广大科学工作者和检验人员的努力下，在普通PCR的基础上改进和派生了许多新技术和新方法。这些衍生的新PCR技术的灵敏度和特异性得到进一步的提高，检测范围得到进一步扩展，从而在疾病诊断、预防与控制领域检验中得到了更广泛的应用[15]。除了能更准确、灵敏地检测标本中的NoV，尤其是低浓度的NoV感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。

3.1 常规RT-PCR技术

刘翼等[16]针对RNA依赖的RNA聚合酶基因区采用Koopmans引物JV12Y/JV13I引物JV12Y位于4552 4572bp引物JV13I位于48584878bp扩增目标片段长度为327bp建立了RT-PCR技术。在358份腹泻患儿粪便中检出NoV 42份，抽取11份进行测序分析与GenBa-nK进行BLASTN库比较证明为NoV。

3.2 多重RT-PCR技术

孙亚萍[17]等应用针对病毒壳体区域设计的4对引物GⅠ-SKF/GⅠ-SKR、COG2F/G2-SKR、SLV5317/SLV 5749、PreCAP1/82b扩增杯状病毒、星状病毒壳体区域的N/S端对于NoV GGⅠ、GGⅡ、札如病毒、星状病毒得到的扩增产物分别为330、387、434、719bp分子量差距大可直接通过琼脂电泳进行鉴定。

3.3 荧光RT-PCR技术

TaqMan荧光探针为线型寡核苷酸荧光基团位于5′端淬灭基团位于3′端在退火阶段探针杂交于DNA模板Taq聚合酶5′-3′核酸外切酶活性将5′端连接的荧光基团从探针上切割下来游离于反应体系中从而脱离了3′端淬灭基团的作用而释放荧光。谭翰清[18]等以高保守区52915376bp作为靶基因、52915310bp为上游引物、53765354bp为下游引物扩增目标片段长度为86bp以53195335bp为探针，建立了NoV GGⅠ型TaqMan-MGB探针。Real-time RT-PCR法与以G1-SKF/G2-SKF为引物的常规RT-PCR相比灵敏度高100倍。司红丽[19]等以比较保守的NoV GGⅡ型的RNA依賴的RNA多聚酶区与衣壳蛋白区的连接区域为靶向扩增区域50065025bp为上游引物、51085 089bp为下游引物扩增目标片段长度为103bp以5048 5070bp为探针建立了NoV GGⅡTaqMan Real-time RT-PCR检测法。所建立的方法在102-109拷贝范围有极好的线性关系，检测体系最低检出限为102拷贝，而常规RT-PCR检测体系最低检出限为103拷贝。与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒无交叉反应。随机抽取20个该法阳性样品将纯化PCR产物连接到PMD18-T载体上进行序列测定结果全部为GGⅡ型NoV。王毅谦20]等就用Allglo探针同时检测GI和GII型NoV的双重荧光反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法，该方法设计针对GI和GII型诺如病毒开放阅读框架ORFl及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针，优化最佳反应条件，以一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系对96份临床粪便标本进行检测，结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100%，且测序结果显示目标序列正确。证明Allglo探针法检测GI和GII型NoV技术特异性好，灵敏度高，可用于感染性腹泻暴发中NoV的快速筛查。还有阮佳、许欣[21]等利用逆转录PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光快速检测法，根据NoV核酸保守序列选择引物，扩增出特异的PCR产物；采用响应曲面法进行毛细管电泳条件优化，以含有DNA荧光染料SYBR Gold的0.5%甲基纤维素为筛分介质，通过激光诱导荧光法检测诺如病毒的PCR产物。在优化的毛细管电泳条件下，9 min内可完成NoV PCR产物的检测。扩增产物测序后，与基因库中NoV的序列进行同源性比对，一致性达99%。迁移时间的日内和日间相对标准偏差分别为1.1%～1.3%和1.8%～2.6%，已用于粪便中NoV的快速检测。

3.4 恒温核酸扩增技术

恒温核酸扩增技术（NASBA）是直接扩增RNA来检测NoV，样品中病原RNA得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于RT-PCR，操作时间短；假阳性率低。吕虹[22]等以恒温快速检测方法进行154例北京地区病毒性腹泻患者粪便标本NoV的检测，同时用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）作对照，评价该方法。结果：在154例病毒性腹泻的病人标本中，采用恒温快速检测方法进行NoV检测，阳性结果61例，阳性率为39.6%，RT-PCR方法进行检测，阳性结果54例，阳性率为35.1%，以RT-PCR为金标准计算，检测灵敏度90.7%（49/54），特异性88%（88/100）。

3.5 基因芯片技术

基因芯片技术是一种大规模集成的固相杂交技术，其基本原理是以核酸分子杂交即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作为探针，检测样品哪些样序列及其互补，然后经过一定的检测系统对杂交信号进行检测，可定性或定量检测，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片技术具有微型化、高通量、高度平行性和高速性的特点[23]。陈广全[24]等将发表在GeneBank中的NoV、星状病毒、轮状病毒、甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒的全序列和部分序列进行比较找到高度保守的核苷酸序列，以此为依据设计引物和探针芯片在4℃条件下保存7-15个月性能稳定。该芯片在毛蚶中检出的GGⅡNoV与RT-PCR结果相对应。史蕾[25]等建立了基于磁珠的可视化基因芯片技术用于NoV快速检测，检测灵敏度为提取NoV GGⅡRNA反转录后的cDNA50ng 20份临床样品与RT-PCR比较均为1份GGⅠ、5份GGⅡ阳性、14份阴性。

4 食物中NoV的检测

RT-PCR检测食物中NoV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。

4.1 病毒浓缩

病毒浓缩NoV浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品pH值，使毒粒与样品微粒分开，PEG把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。目前对于固体样品PEG沉淀法是最有效的浓缩方法。膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。陆建荣[26]等曾用过这种方法检测海水、生活污水中的NoV，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。

4.2 核酸提取

食品样品中所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是RT-PCR反应抑制因子。NoV是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。目前应用较成熟广泛的是胍法RNA提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly（dT）或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀RNA相比起来，效果较好，只是成本偏高。广西邓丽丽、刘巍[27]等应用优化甘氨酸缓冲液处理牡蛎匀浆液，当PEG沉淀浓度为16%时的NoV RNA富集提取效果病毒最好，提取后采用荧光定量RT-PCR方法对牡蛎样品中的NoV进行检测，取得了较好的检测效果。

5 展望

综述诺如病毒的检测方法，从电镜法、免疫法到目前应用最广的分子生物学法，各有其优缺点。选择一种适用于自己实验室的检测试剂和方法是广大检验工作者面临的问题，电镜法设备昂贵不适用日常检测之用；ELSIA法简便快速、灵敏度和特异性较高较适合基层实验室使用，只是试剂成本较高，免疫层析法操作使用最为便捷，但是灵敏度还没法与各类检测法相比，且国内还法生产此类产品，使应用范围受到很大限制；条件较好的实验室倾向使用各类基因检测法，它具有高检测效率、高灵敏度和用时短的优点，其中Real-time RT-PCR的检出痕达102，是其他检测方法无法比较的。只是目前所用的NoV检测系统和检测试剂大多是国外品牌，且价格较贵，操作技术相对复杂，对检测环境、检测条件及检测人员的技术水平的要求较为苛刻，还有食品类样品中NoV的检测操作费时繁琐。因此还有待国内相关科技人员的努力，尽快开发出高通量、高灵敏度和高特异和使用简便快速的NoV检测试剂，为国内市场提供价廉质优的产品，促进NoV检测的开展，为NoV的防控提供技术支持。

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