内生细菌BEB33的分离、鉴定及对香蕉枯萎病的生防作用评价

朱森林等

摘 要 从健康香蕉植株根内分离得到1株对香蕉枯萎病病原菌FOC4具有强抗菌活性的内生细菌。通过形态观察、生理生化特性测定及分子分析，鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌，编号为BEB33。平板对峙和盆栽苗评价结果表明，该菌株对香蕉枯萎病具有较好的生防作用；该菌株发酵产物的拮抗活性对温度、pH不敏感；进一步研究表明，该菌株能够产IAA促进香蕉植株生长，同时产生铁载体，具有较好的生防潜力。

关键词 内生细菌BEB33；拮抗作用；促生；铁载体

中图分类号 Q939.11 文献标识码 A

Isolation of Endophytic Bacterial BEB33 and Its Bio-control

Evaluation Against Banana Fusarium Wilt

ZHU Senlin1，2， LIU Xianbao2， CAI Jimiao2， CHEN Yipeng2， HUANG Guixiu2 *

1 Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry

of Agriculture / Hainan Key Laboratoryfor Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract An endophytic bacteria of strong antibacterial activity to Fusarium wilt of banana（FOC4）was isolated from healthy banana plant roots. By observation of morphological，physiological and biochemical characteristics and sequences analysis，it was identified as Bacillus amyloliquefaciens，numbered BEB33. The antagonism of BEB33 was evaluated by confront culture and potted seedlings test. The results showed that the strain had biocontrol effects to banana Fusarium wilt. The antagonistic activity of its fermentation product was insensitive to temperature and pH. Further studies showed that the strain could produce IAA to promote banana plant growth and siderophores. All above results indicated that the BEB33 is of good bio-control potential.

Key words Endophytic bacteria BEB33； Antagonistic efficacy； Plant growth promoting bacteria； Siderophore

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.024

香蕉（Musa nana Lour.）是世界上最重要的水果之一。2011年，全球香蕉年产量达10 654.2万t，进出口总量达3 539.2万t，贸易额达197.6亿美元[1]，超过柑橘成为世界第一大贸易水果。然而，香蕉的各种病害制约了其产业的发展，而由尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病危害最为严重。使用化学肥料和农药可提高其产量并有效控制其病害，但使用化学药剂有污染环境、破坏生态平衡、诱导病菌抗性等不利影响。因此，减少化学肥料和农药的使用，通过改善和调节植物体内、体表和根际有益微生物的种群和数量，发挥微生物对植物的促生和诱抗作用，是现代绿色农业健康发展的方向。植物内生菌作为一类对环境无公害的微生物资源，为提高香蕉产量和病害的生物防治提供了新的微生物来源。

植物内生菌包括内生细菌、内生真菌、放线菌等，因其能在植物组织内长期存活，故对于植物病害具有独特的生物防治优势。众多研究表明，内生菌具有促生作用和抗病作用，已发现的作用机制包括：合成或促进植物合成多种植物生长激素、生物固氮、合成铁载体、溶磷、产ACC脱氨酶等[2-4]；通过产生抗菌物质、竞争生态位、营养及诱导寄主产生系统性抗性等机制来防治植物病害的发生[5-6]。近年来，关于香蕉内生菌的研究文献不断增多，主要集中在内生菌资源的收集、多样性分析和生物学作用评价等方面[7-11]。但对香蕉内生菌的促生作用研究较少，特别是很少筛选到既具生防效果又具促生作用的菌株。本文报道一株既具拮抗香蕉枯萎病菌活性又有促进香蕉植株生长的香蕉内生细菌菌株的分离、鉴定及其相关的生防促生生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西蕉，采自海南省临高市黄铜镇香蕉种植园。

1.1.2 病原菌菌株 香蕉枯萎病病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（FOC4）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.3 试剂 NA培养基、LB培养基、PDA培养基和CAS培养基的配方均参照《植病研究方法》[12]。Taq酶和dNTPs购于天根生化科技（北京）有限公司，PCR产物回收试剂盒、pMD18-T克隆载体和感受态细胞均购于宝生物工程（大连）有限公司。16S rDNA及recA基因部分序列扩增引物由华大基因科技有限公司合成，16S rDNA引物序列为：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAGT T-3′。recA基因引物序列为：recAf：5′-TGAGTGATCGTCAGGCAG

CCTTAG-3′和recAr：5′-TTCTTCATAAGAATACCA

CGAACCGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌的分离、纯化、筛选 采集香蕉枯萎病发病区健康香蕉植株的根，参照付业勤[13]的方法分离其内生菌。采用研磨法分离筛选对香蕉枯萎病菌具有拮抗活性的内生细菌。

1.2.2 内生细菌菌种鉴定 参照《常见细菌鉴定手册》[14]和《微生物实验技术手册》[15]进行菌落形态观察、生理生化特征测定。16S rDNA及recA基因的部分序列分析：参照文献[16]进行DNA提取，参照戴英葵[17]方法进行16S rDNA序列扩增，参照Alvarez[18]方法进行recA基因的序列扩增。PCR产物经连接转化后，各挑选3个克隆子送华大基因生物公司进行测序确定其序列。通过 BLAST 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对分析，并筛选近源物种的序列用于系统发育分析。

1.2.3 内生性测定 通过诱导抗性的方法获得抗链霉素标记的菌株，将抗性标记菌株接种香蕉苗后第 3天和第5天，参照陈博等[19]的方法进行回收测定并计算回收菌落数。

1.2.4 菌株的生防特性及发酵液活性粗提物的稳定性测定

（1）菌株BEB33对香蕉盆栽苗的防治效果评价：挑取菌株单菌落于LB液体培养基中。28 ℃，180 r/min振荡培养36 h后。将细菌悬浮液浓度调至1×106 cfu/mL。FOC4在PDA液体培养基上28 ℃，180 r/min振荡培养7 d。用无菌纱布过滤除去菌丝。将孢子悬浮液的浓度调至1×107个/mL。挑取株高为25 cm、健康、基因型一致的香蕉组培苗种植于装有已消毒土壤的花盆中。采用灌根法接种，每株浇灌100 mL BEB33，以接培养基对照。每处理30株。7 d后，每株浇灌100 mL的FOC4。90 d后调查植株发病情况，参照病情指数分级标准计算不同处理的病情指数和防效[12，19]。

（2）菌株BEB33平板对峙活性测定：平板对峙实验参考陈博[19]的实验方法。以不接内生细菌分离物平板作为对照，设3个重复。抑制率/%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

（3）菌株BEB33蛋白酶活性测定：将供试菌株接种于脱脂牛奶培养基平板上，37 ℃培养24 h后观察菌落周围是否产生的透明圈，设3个重复。

（4）参照代森[20]的方法进行粗提液的制备：①热稳定性测定：将粗提液分别经-20、0、20、40、60、80、100 ℃处理1 h，120 ℃高压灭菌处理20 min，采用滤纸片对峙法进行拮抗活性检测[21]。3 d后测定其抑制圈直径，3次重复。②pH稳定性测定：配置pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的20%乙睛溶液。将20%乙睛溶液溶解的粗提物吸取100 μL于1.5 mL PE管中，采用冷冻干燥法将其抽干。用100 μL不同pH的20%乙睛溶液溶解粗提物。以未处理粗提物溶液作为对照，测定方法同上。定义未处理粗提物溶液对照组的抑菌活性定为100%。

1.2.5 菌株促生特性分析 菌株对香蕉盆栽苗的促生作用评价：选取基因型相同、健康、株高一致的香蕉袋装苗种植于口径为22 cm盆中，待香蕉苗稳定生长后，将BEB33的菌悬浮液浓度调至1×106 cfu/mL。采用灌根法接种香蕉苗，每株接种量为100 mL，以只接培养基作为空白对照，每处理30株，30 d与60 d后记录株高、干重、鲜重。

菌株对香蕉盆栽苗的促生特性分析：参照王亚艺[22]、李倍金[23]、Glickmann[24]的方法进行溶磷能力、固氮活性、产吲哚乙酸（IAA）特性测定。

参照Schwyn和Neilands[25]的方法，用CAS比色法测定铁载体含量。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离及拮抗性菌株的筛选

培养3 d后，平板表面逐渐形成颜色、大小和形状等均不相同的菌落，而对照处理的NA平板上，无菌落生成，表明表面消毒彻底。挑取不同类型的菌落，划线纯化后共分离得到内生细菌49份。通过与FOC4小种的对峙培养，筛选到1株对FOC4生理小种有较好拮抗作用的内生细菌，编号为BEB33（图1）。

2.2 菌株BEB33的鉴定

2.2.1 菌落形态和生理生化特征 BEB33革兰氏染色呈阳性，长杆状，产芽孢，有荚膜，稀疏周生鞭毛。该菌株在LB平板上生长良好，单菌落呈圆形，边缘不整齐，有隆起，表面褶皱，不透明，表面干燥，菌落呈浅黄色；LB液体培养静止时有菌膜形成。其生理生化特征见表1。

2.2.2 分子鉴定 利用细菌16S rDNA通用引物对BEB33基因组DNA进行PCR扩增，获得大小为1.5 kb左右的片段，克隆测序后确认其长度为1 517 nt，GenBank登录号为（KJ009336）。将该序列与GenBank相关数据进行BLAST 分析，用Neighbor-Joining 构建系统发育树（图2），结果显示，系统发育树上与菌株BEB33同源性较高的均为类芽孢杆菌属，与菌株Bacillus amyloliquefaciens IT45的同源性达到99.87%，与菌株Bacillus polyfer的同源性为 99.74%，与菌株B. subtilis 168的同源性为99.47%。为了进一步确定BEB33分类地位，对BEB33的recA基因片段进行扩增测序，结果显示其长度为872 nt，GenBank 登录号为（KJ009337），与GenBank相关数据进行BLAST相似性分析，构建系统发育树（图3）。结果显示，BEB33与Bacillus amyloliquefaciens同源性达99%，与B. subtilis同源性为86%；与B.atrophaeus同源性为85%。

综合其菌落形态、生理生化、16S rDNA和recA基因的实验结果。将BEB33鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

2.3 BEB33内生性测定

获得抗硫酸链霉素的BEB33抗性突变菌株，测定其对FOC4的拮抗活性，结果表明：拮抗活性不变。将该突变菌株接种于香蕉组培苗，3 d与5 d后取接种香蕉苗叶片和根组织进行内生细菌的分离。实验结果表明，3 d后该菌株能够在根部定殖，5 d后该菌株能够在香蕉植株根部和叶片定殖。

2.4 BEB33菌株的生防特性

人工接种90 d后，香蕉盆栽苗抗性评价结果显示，处理组发病率与病情指数都比对照组明显降低，处理组的平均发病率和病情指数分别为40.00%、14.76%，对照组的平均发病率和病情指数分别为86.67%、55.71%；其防效为73.51%。平板对峙培养试验结果表明，培养5 d抑制率达到53.7%；产蛋白酶活性测的试验结果发现，该菌株能够在脱脂牛奶平板上产生透明圈，即具有蛋白酶活性。

菌株BEB33发酵液经过酸沉淀获得活性物质粗提物，活性物质稳定性评价结果见表2和表3。实验结果表明，该菌株活性物质对温度不敏感，各温度处理间差异不显著；活性物质对pH2～11不敏感，处理间差异也不显著，但pH为12时，该活性物质活性有所下降，为对照组的93.41%。

2.5 BEB33菌株促生特性

通过盆栽实验对香蕉促生作用评价，实验结果表明，经菌株BEB33处理的香蕉苗株高、鲜重和长势都显著高于对照（图4）。促生特性分析结果表明，菌株BEB33在溶磷检测平板上不能产生溶磷圈，说明该菌株不具备溶磷能力；固氮性检测结果发现，该菌株能在Ashby培养基平板上稳定生长，但不能在Nfb培养基平板上正常生长，说明该菌株不具备固氮活性；菌株BEB33经液体发酵培养后发现能产生植物激素IAA，培养7 d后产量达到24.47 mg/L。

该菌株能在CAS铁载体检测平板上产生透明黄色的圈，说明具有产生铁载体能力（图5）。参考张科立[26]方法，测定其OD600值为630。实验结果表明BEB33属于高产铁载体菌株。

3 讨论与结论

芽孢杆菌属包含许多亲缘关系较近的种[27]。其中，B. subtilis和B. amyloliquefaciens 2个种表型非常相似，鉴定时很容易被混淆，要借助分子手段才能将2种菌有效地区分开[28]。在细菌鉴定和系统发育树构建中，16S rDNA序列分析是最常用的方法，但B. amyloliquefaciens和B. subtilis之间序列的高度相似性已经限制了其结果有效性，目前利用编码蛋白基因作为系统发育标记已成为常用的方法[27，29]。recA基因是编码DNA修复和重组蛋白的基因，Arguelles[30]和Alvarez等[31]利用该基因序列和16S rDNA序列准确鉴定了B. amyloliquefaciens的不同菌株；本研究对内生细菌BEB33的16S rDNA序列和recA基因序列进行分析，并构建了系统发育树。在以16S rDNA序列为基础构建的系统发育树中，BEB33与B. amyloliquefacien聚在同一分支，但与其它种的遗传距离也比较近，相似性最高达99.47%；而在利用recA基因序列构建的系统发育树中，BEB33与B. amyloliquefacien不仅聚类在同一分支，而且该菌株与其它种的遗传距离较远，相似性最高的只有86%。这些确保了BEB33鉴定的准确性。

据报道，Bacillus amyloliquefaciens可以通过产生挥发气体化合物、铁载体和IAA等促进宿主植物生长，通过非核糖体途径合成iturin、surfactin和fengycin等多肽抑制病原真菌生长，有效防治病害发生[30-32]。 Chen等[33]对具有促生作用的植物共生细菌Bacillus amyloliquefaciens FZB42进行了全基因组测序，分析了与聚酮类化合物（polyketide，PK）、非核糖体多肽（nonribosomal peptide，NRP）及IAA代谢相关的基因。Vitullo等[34]研究发现Bacillus amyloliquefaciens BO7能够有效防治由Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici引起的番茄根部病害的发生，并明确BO7与病原菌和宿主植物之间的相互作用机制。本研究定性和定量检测发现，筛选获得的香蕉内生细菌Bacillus amyloliquefaciens BEB33属高产铁载体和IAA菌株，对香蕉植株有一定的促生作用；在平板对峙和盆栽实验中，BEB33对Fusarium oxysporum f.sp cuben及其引起的香蕉枯萎病都有很好的抑菌和生防效果。该菌株在菌肥和生物农药方面具有很好的开发潜力，但具体促生和生防机制还有待进一步研究。

参考文献

[1] Fao J， Foods M H. Food and Agriculture Organization of the United Nations[J]. Rome， URL：http：//faostat. fao. Org.

[2] Davison J. Plant beneficial bacteria[J]. Nature Biotechnology， 1988， 6： 232-235.

[3] Luarovits G， Nowak J. Rhizobacteria for improvement of plant growth and establishment[J]. Hortsience， 1997， 32（2）： 188-192.

[4] Schippers B， Bakker A W. Beneficial and deleterious e～cts of HCN producing pscudomonas rhizophere interactions[J]. Plant Soil， 1990， 129（2）： 75-83.

[5] Huang J. Ultrastructure of bacterial penetration in plants[J]. Annual review of phytopathology， 1986， 24（1）： 141-157.

[6] Ramamoorthy V， Viswanathan R， Raguehander T， et al. Induction of systemic resistance by plant growth promoting rhizobacteria in crop plants against pest and diseases[J]. Crop protection， 2001， 20（1）： 1-11.

[7] Weber O B， Muniz C R， Vitor A O， et al. Interaction of endophytic diazotrophic bacteria and Fusarium oxysporum f. sp. cubense on plantlets of banana ‘Maca[J]. Plant and soil， 2007， 298（1-2）： 47-56.

[8] Thomas P， Swarna G K， Roy P K， et al. Identification of culturable and originally non-culturable endophytic bacteria isolated from shoot tip cultures of banana cv. Grand Naine[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2008， 93（1）： 55-63.

[9] 付业勤， 蔡吉苗， 刘先宝， 等. 香蕉内生细菌分离， 活性评价及数量分布[J]. 热带作物学报， 2008， 28（4）： 78-83.

[10] 潘羡心， 彭建华， 刘先宝， 等. 一株产铁载体香蕉拮抗内生细菌的分离及鉴定[J]. 热带农业工程， 2009， 33（4）： 4-8.

[11] 吕恒玉. 内生细菌诱导香蕉系统抗病性的初步研究[D]. 海口： 海南大学， 2008.

[12] 方中达. 植病研究方法[M]. 3版. 北京： 中国农业出版社， 1998： 177-197.

[13] 付业勤， 张科立， 潘羡心， 等. 内生拮抗细菌BEB2的分子鉴定及其对香蕉枯萎病菌的抑制作用[J]. 热带作物学报， 2009（1）： 114-118.

[14] 东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社， 2001： 349-398.

[15] 沈 萍， 范秀容， 李广武. 微生物学实验[M]. 北京： 高等教育出版社， 2002.

[16] 萨姆布鲁克 J， 拉塞尔DW. 分子克隆实验指南[M]. 第3版. 黄培堂， 等译. 北京： 科学出版社， 2002： 26-32.

[17] 戴英葵， 刘先宝， 张科立， 等. 香蕉嗜铁内生细菌 BEB99 的分离鉴定及其抗病促生能力评价[J]. 热带作物学报， 2012， 33（5）： 913-918.

[18] Alvarez F， Castro M， Príncipe A， et al. The plant‐associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP218 and ARP23 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease[J]. Journal of applied microbiology， 2012， 112（1）： 159-174.

[19] 陈 博， 朱 军， 孙前光， 等. 一株抗香蕉枯萎病内生细菌的分离鉴定及其抗病促生作用[J]. 微生物学通报， 2011， 38（2）： 199-205.

[20] 代 森. 解淀粉芽孢杆菌抑菌物质分离和调控研究[D]. 天津： 南开大学， 2011.

[21] 韩欣宇， 陈志厚， 罗定棋， 等. Tpb55菌株发酵液中活性代谢产物的抑菌作用及稳定性测定[J]. 中国农学通报， 2012， 28（27）： 260-264.

[22] 王亚艺， 李松龄， 蔡晓剑， 等. 青海解磷菌菌株的分离筛选[J]. 河北农业科学， 2012， 16（2）： 62-64.

[23] 李倍金. 禾草内生固氮菌的分离及固氮促生效能研究[D]. 乌鲁木齐： 新疆农业大学， 2008.

[24] Glickmann E， Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and environmental microbiology， 1995， 61（2）： 793-796.

[25] Schwyn B， Neilands J B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J]. Analytical biochemistry， 1987， 160（1）： 47-56.

[26] 张科立. 香蕉嗜铁内生细菌BEB3的分离鉴定及其生防机理初探[D]. 海口： 海南大学， 2010.

[27] Wang L T， Lee F L， Tai C J， et al. Comparison of gyrB gene sequences， 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2007， 57（8）： 1 846-1 850.

[28] Reva O N， Dixelius C， Meijer J， et al. Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis[J]. FEMS Microbiology Ecology， 2004， 48（2）： 249-259.

[29] Zeigler D R. Gene sequences useful for predicting relatedness of whole genomes in bacteria[J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology， 2003， 53（6）： 1 893-1 900.

[30] Arguelles-Arias A， Ongena M， Halimi B， et al. Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens[J]. Microb Cell Fact， 2009， 8（63）： 1-12.

[31] Alvarez F， Castro M， Príncipe A， et al. The plant‐associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP218 and ARP23 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease[J]. Journal of applied microbiology， 2012， 112（1）： 159-174.

[32] Idris E S E， Iglesias D J， Talon M， et al. Tryptophan-dependent production of indole-3-acetic acid（IAA）affects level of plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Molecular plant-microbe interactions， 2007， 20（6）： 619-626.

[33] Chen X H， Koumoutsi A， Scholz R， et al. Genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 reveals its potential for biocontrol of plant pathogens[J]. Journal of biotechnology， 2009， 140（1）： 27-37.

[34] Vitullo D， Di Pietro A， Romano A， et al. Role of new bacterial surfactins in the antifungal interaction between Bacillus amyloliquefaciens and Fusarium oxysporum[J]. Plant Pathology， 2012， 61（4）： 689-699.

责任编辑：叶庆亮