荔枝霜疫霉游动孢子及卵孢子生物学特性研究

张荣等

摘 要 为了更深入理解荔枝霜疫霉在果园内侵染流行规律，利用植物病理学方法，通过离体培养研究了环境因素对荔枝霜疫霉游动孢子释放、萌发及卵孢子萌发的影响。结果表明，在荔枝果肉培养基中，孢子囊萌发的温度等于或小于孢子囊形成的温度时，孢子囊主要以释放游动孢子的方式萌发，28 ℃是荔枝霜疫霉孢子囊释放游动孢子的临界温度。荔枝霜疫霉在荔枝果肉培养基中，于26 ℃下培养7 d后，游动孢子释放最适温度范围为12～20 ℃，最适pH值为5～7；游动孢子萌发的最适温度为20～24 ℃，最适pH值为7～9；孢子囊在水滴中才释放游动孢子，游动孢子在水滴中方可萌发。荔枝霜疫霉在荔枝果皮和叶片煎汁培养基中均可产生卵孢子。当温度为28 ℃，pH值为5，12 h光暗交替光照时，卵孢子的萌发率最高，可达到49.68%；温度是影响孢子囊萌发和萌发方式的主要因素，水是游动孢子释放和萌发的必要条件。卵孢子广泛存在于果园中，为翌年初侵染源；荔枝霜疫霉主要以游动孢子再次侵染寄主。

关键词 荔枝霜疫霉； 游动孢子； 卵孢子； 生物学特性

中图分类号 S667.1 文献标识码 A

Biological Characteristics of Zoospore

and Oospore of Peronophythora litchii

ZHANG Rong1，CHEN Junqiao1，JIANG Zide2，CHEN Houbin1

1 College of Horticulture，South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642，Chiana

2 Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control，

South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642，Chiana

Abstract In order to understand how Peronophythora litchii spread in litchi orchard， the biological characteristics of zoospore and oospore germination were investigated in vitro by phytopathological research methods. Different means of germination by sporangia were determined by using temperature gradients. If the germinating temperature of sporangia was equal to or below the culture temperature， the sporangia germinated as releasing the zoospores. No zoospores were released if P. litchii was kept at 28 ℃ or higher. When P. litchii was cultured at 26 ℃ on 20% litchi flesh agar， the optimal temperature for zoospore release was 12-20 ℃ and the optimal pH was 5-7. The optimal temperature for zoospore germination was 20-24 ℃ and the pH was 7-9. Release of zoospores by sporangia and germination of zoospores relied on the availability of water. The oospores of P. litchii could generate in a juice medium of the litchi pericarp and leaf. The highest germinating rate of oospores was 49.68% which was achieved under optimal conditions at 28 ℃， pH 5 and 12 h alternating illumination. Oospores throughout the litchi orchard are a source of primary inoculum of P. litchii. Rainfall， night and morning dew in the litchi orchard is conducive to zoospore colonization and infection host.

Key words Peronophythora litchii；Zoospore；Oospore；Biological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.023

荔枝霜疫霉病最早于1934年在我国台湾地区发现[1]，而后华南农学院于1959年在广东腐烂的荔枝果实上发现此病害[2]。目前主要分布在中国、泰国、越南、巴布亚新几内亚等国家。荔枝霜疫霉病的病原菌为荔枝霜疫霉（拉丁学名： Peronophythora litchii Chen ex Ko et al）。根据第8版《真菌字典》[3]，此菌隶属于假菌界（Chromista）、 卵菌门（Oomycota）、卵菌纲（Oomycetes）、 霜霉目（Peronosporales）、 霜疫霉科（Peronophythoraceae）、 霜疫霉属（Peronophythora）。该科仅有1属1种。

荔枝霜疫霉病是发生在荔枝上非常严重的病害，该菌从荔枝抽出花穗到果实成熟至采后贮运整个过程都可造成极大危害，不仅可以为害近成熟的果实，也可为害花序、结果小枝、幼果、果柄。高湿时，嫩叶也可发病[4]；1995年泰国首次发现荔枝霜疫霉可以为害5～20年生的Kom和Songkanan荔枝树根部，引起侧根变褐腐烂，导致树体死亡[5]。

荔枝霜疫霉生物学特性已有很多研究，但是不同来源菌株生物学特性略有差异。例如Kao等[6]和Chen等[7]认为台湾地区的荔枝霜疫霉在V8汁培养基中，菌丝最适生长温度为24～28 ℃；Liu等[8]认为广东省的荔枝霜疫霉在PDA淀粉培养基中，菌丝最适生长温度为28～30 ℃；蔡学清等[9]研究福建省荔枝霜疫霉在PDA培养基中，菌丝生长最适温度为24 ℃。可见不同地区荔枝霜疫霉生长最适温度有差异。孢子囊萌发方式各学者意见不一。Kao等[6]研究发现，将培养在26 ℃下的孢子囊，放在8～24 ℃下均可萌发成游动孢子，温度大于等于26 ℃不能释放游动孢子。然而在16 ℃培养的孢子囊，经4～12 ℃冷处理下均可萌发成游动孢子，温度大于16 ℃无游动孢子释放。蔡学清等[10]研究认为培养基、光照、菌龄和温度均影响孢子囊萌发方式。关于pH值对荔枝霜疫霉菌丝生长已有多人报道[6-10]，而pH值对荔枝霜疫霉游动孢子释放和游动孢子萌发未见报道。对于同宗配合荔枝霜疫霉而言，有性生殖产生的卵孢子抗逆性非常强，在土壤和病残体上越冬，是病害流行主要初侵染源。仅见Pao[11]等报道了卵孢子的萌发方式，关于营养成分对卵孢子产生的影响、卵孢子萌发的影响因素未见报道。

荔枝霜疫霉在果园侵染菌态为孢子囊和游动孢子，越冬形态为卵孢子，但有关环境因子对游动孢子释放及萌发，卵孢子的萌发等相关研究国内外鲜有报道。本文就此方面进行了研究，为探索荔枝霜疫霉的发生发展规律和利用农业措施控制该病害提供理论依据，并为研究荔枝霜疫霉有性生殖生物学和遗传变异奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：荔枝霜疫霉，从高州市根子镇白糖罂果实上分离。

供试培养基及配方：分别称取200 g荔枝果肉、荔枝果皮、荔枝新叶、荔枝老叶、龙眼果皮、胡萝卜，用榨汁机绞碎，双层纱布过滤后，定容至1 000 mL，加入13 g琼脂粉配制成固体培养基。

1.2 方法

1.2.1 孢子囊形成温度及其萌发温度对游动孢子释放的影响 将荔枝霜疫霉在荔枝果肉培养基中分别于16、20、26、28、30 ℃下培养7 d后，用无菌水将不同温度下生长的霜疫霉迅速配成浓度约为15个孢子囊/视野（100倍）孢子囊悬浮液。将各种孢子囊悬浮液滴于凹玻片上，再分别置于12、16、20、24、26、28 ℃温度下黑暗培养2 h后，迅速滴入10 μL曲利苯蓝染色剂固定，统计游动孢子释放率。

1.2.2 环境因子对霜疫霉游动孢子释放的影响 将荔枝霜疫霉在荔枝果肉培养基中于26 ℃下培养7 d后，用无菌水迅速配成浓度约为15个孢子囊/视野（100倍）孢子囊悬浮液。将孢子囊悬浮液滴于凹玻片上，置于设定的条件下黑暗培养2 h后，迅速滴入10 μL曲利苯蓝染色剂固定，统计游动孢子释放率。每次检查10个视野，约150个孢子囊，重复3次。

设置试验温度分别为12、16、20、24、28 ℃ 5个处理；用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制pH分别为3、5、7、9、11的水溶液；在密闭容器内用不同盐的饱和溶液调制成空气相对湿度分别为66%、75%、81%、90%、93%、98%，以水滴为100%湿度，置于20 ℃下培养[12]。

1.2.3 环境因子对霜疫霉游动孢子萌发的影响 用无菌水迅速配成浓度约为15个孢子囊/视野（100倍）孢子囊悬浮液，置于16 ℃黑暗培养2 h后，用孔径为20 μm的滤膜过滤混合液，即可除去孢子囊，配制得到游动孢子悬浮液。将游动孢子悬浮液与荔枝果皮液体培养基等体积混合滴于凹玻片上，分别置于设定的条件下黑暗培养1 h，滴入10 μL曲利苯蓝染色剂固定，统计游动孢子萌发率。每次检查10个视野，约150个孢子囊，重复3次。

试验设置的温度、pH值和湿度同上。

1.2.4 不同培养基对霜疫霉卵孢子产生的影响 参照郑小波[13]等的方法，略加改进。将5 mm大小的菌碟置于不同营养成分的培养基平板（15 mL培养基/皿，直径9 cm）中，用parafilm膜密封培养皿，黑暗培养30 d。以接种点为中心，在2 cm×2 cm正方形的四个角分别切取4块大小为0.5 cm×0.5 cm的菌丝块，压片，于100倍视野下随机观察10个视野内卵孢子量，计算平均值。重复3次。

1.2.5 霜疫霉卵孢子获取方法 将霜疫霉培养在胡萝卜固体培养基中，置于26 ℃下60 d后，将培养基块（3 cm×l cm）放到灭菌的小烧杯中，加10 mL无菌水，用高速匀浆机（9 500 r/min）匀浆1.5 min，匀浆液经孔径76、54 μm筛网过滤，滤液用15 mL离心管收集，置于-20 ℃冰箱中7 h后，再3 500 r/min离心2 min富集，获得卵孢子悬浮液，置-4 ℃冰箱中备用[14-15]。

1.2.6 环境条件对荔枝霜疫霉卵孢子萌发的影响 参照左豫虎[16]等的方法，略加改进。将滴有卵孢子悬浮液的水琼脂培养皿分别置于12、16、20、24、28、32 ℃ 6个不同温度下；用0.1 mol/L柠檬酸、0.2 mol/L磷酸盐、0.1 mol/L盐酸、0.05 mol/L硼砂、0.1 mol/L氢氧化钠配制pH分别为3、5、7、9、11的水琼脂培养基；设置连续黑暗、连续光照、12 h光暗交替光照的条件；观察卵孢子的萌发状况，计算萌发率。

1.3 数据统计

以上试验数据均采用邓肯氏新复极差法（DMRT）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 温度对霜疫霉孢子囊释放游动孢子的影响

荔枝霜疫霉孢子囊不同温度下释放游动孢子与孢子囊形成温度有关。由表1可知，当孢子囊萌发的温度≤孢子囊形成的温度时，孢子囊就会以释放游动孢子的方式萌发。在16 ℃下培养形成的孢子囊，当温度>16 ℃时，在2 h内没有释放游动孢子；在20 ℃下培养形成的孢子囊，所置温度>20 ℃时，在2 h内没有释放游动孢子；在28 ℃下培养形成的孢子囊，置于不同温度下，其游动孢子释放率随着温度升高而降低；在30 ℃下培养形成的孢子囊，置于不同温度下，均不能释放游动孢子。28 ℃是荔枝霜疫霉孢子囊释放游动孢子的临界温度。

2.2 温度对游动孢子释放和游动孢子萌发的影响

不同温度下，游动孢子释放率和萌发率有所不同。当温度为24 ℃时，游动孢子释放率为63.25%，随着温度降低游动孢子释放率高达85%以上，且在20、16、12 ℃下游动孢子释放率不存在显著差异。游动孢子萌发的最适温度为24～20 ℃，萌发率分别为54.46%和51.50%；其次是28 ℃，萌发率为43.85%；16 ℃以下低温不利于游动孢子萌发（见图1）。

2.3 pH值对游动孢子释放和游动孢子萌发的影响

由图2可知，当pH值为5时，游动孢子释放率最高，达89.73%，最适游动孢子释放的pH值范围是为5～7。游动孢子萌发的最适pH值范围为7～9，游动孢子萌发率为46.15%～52.11%。

2.4 湿度对游动孢子释放和游动孢子萌发的影响

水是霜疫霉游动孢子释放和游动孢子萌发的必要条件，研究表明在20 ℃的水滴中，游动孢子的释放率和萌发率分别为85.17%和51.50%。相对湿度为98%时，游动孢子的释放率和萌发率分别降到9.09%和0。

2.5 环境因素对卵孢子萌发的影响 试验结果表明，供试的6种培养基中，荔枝霜疫霉在胡萝卜培养基中产生的卵孢子量最多，为102.6个/视野，极显著高于荔枝煎汁培养基；在荔枝煎汁培养基中，产生卵孢子量由多到少依次为荔枝新叶培养基、荔枝果皮培养基、荔枝老叶培养基；而在荔枝果肉和龙眼果皮培养基中不产生卵孢子（见表2）。

卵孢子作为主要的初侵染源，温度、pH值、光照对卵孢子的萌发起着重要的作用。由表2可知，当温度为28 ℃，pH值为5，12 h光暗交替光照时，卵孢子的萌发率最高，可达到49.68%。

3 讨论

温度决定孢子囊萌发方式。当孢子囊萌发温度等于或低于孢子囊形成的温度时，孢子囊主要以释放游动孢子的方式萌发，28 ℃是荔枝霜疫霉孢子囊释放游动孢子的上限温度。但是，温度对孢子囊萌发的影响各学者意见不一，戚佩坤等[4]认为在玉米粉培养基中24 ℃下培养7 d荔枝霜疫霉，当温度低于24 ℃时，才能以游动孢子的形式萌发，且萌发率在8～16 ℃下最高；liu等[8]认为孢子囊萌发的最适温度是26～30 ℃；蔡学清等[10]研究表明在24 ℃培养的荔枝霜疫霉，温度为16～24 ℃时孢子囊萌发形成游动孢子，在26 ℃以上萌发形成芽管。上述3篇文章中均未提到孢子囊形成的温度与孢子囊萌发时温度的关系。本研究认为孢子囊形成时的温度影响其在不同温度下孢子囊萌发方式，此观点与Kao等[9]研究结果相同。当孢子囊萌发的温度小于或等于孢子囊形成的温度时，孢子囊主要以释放游动孢子的方式萌发。在果园内，随着降雨的持续，果园温度必然降低，孢子囊形成的温度高于游动孢子释放的温度，且低于游动孢子释放的临界值28 ℃，进一步证明荔枝霜疫霉在果园内主要是释放游动孢子行再次侵染的。游动孢子释放的需冷机制在疫霉属中已有大量研究，普遍认为这种需冷机制受到Ca2+和磷脂的调控[17]。霜疫霉游动孢子释放是否与其有关有待于进一步研究。

pH值影响游动孢子释放和萌发。本研究认为中性偏酸有利于游动孢子的释放，而中性偏碱的环境则会促进游动孢子萌发。水是霜疫霉游动孢子释放和游动孢子萌发的必要条件。游动孢子释放和萌发的生物学特性研究表明降雨和雨后荔枝园内的环境、夜晚及早晨的露水均有利于游动孢子的定植和侵染。自然状态下，雨水多呈中性，可以通过雨前对荔枝树喷撒石灰粉，使树围雨滴的pH值增大，从而抑制游动孢子的释放，实践证明此方法在一定程度上降低了霜疫霉的为害。有学者推测孢子囊和游动孢子需水的萌发机制，可以解除孢子囊和游动孢子萌发的抑制物质，这种机制的研究将在此类病害田间防治上有重要意义，但是相关研究鲜有报道[18]。

卵孢子作为荔枝霜疫霉初侵染源，本文首次报道了荔枝霜疫霉卵孢子的生物学特性。研究表明卵孢子可以在荔枝叶片、荔枝果皮上形成；当温度为28 ℃，pH值为5，12 h光暗交替光照时，其萌发率最高。降低霜疫霉初侵染源的基数对控制该病害的流行有重要意义。在温度、降雨、pH值和光照4个因素中，荔枝园内的温度、降雨和光照很难人为控制，只有pH值是可控因素，可以使用树盘下施用胶体硫、石灰粉等方式改变土壤pH值，降低卵孢子萌发率；另外，通过农业措施也可以减少初侵染源，比如果园间伐和覆地膜，减少或者阻断初侵染源萌发，降低荔枝霜疫霉的为害。

总之，通过离体培养研究环境因子对荔枝霜疫霉生物学特性的影响有利于更深入理解病害在果园内侵染流行，为进一步制定防治措施奠定理论基础。

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责任编辑：凌青根