枇杷鲨烯合酶（Squalene synthase）基因的克隆及序列分析

摘 要 鲨烯合酶（SQS）是枇杷三萜酸生物合成过程中的关键酶。以枇杷（Eriobotrya japonica L.）悬浮培养细胞为材料，采用RT-PCR和RACE方法分离得到枇杷鲨烯合酶Ej-SQS（Squalene synthase）基因的cDNA全长序列（GenBank，JQ294055），共1 775 bp，包含了5′非编码区为97 bp，开放阅读框为1 239 bp，3′非编码区为439 bp。该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列（含412个氨基酸）与其它植物SQS具有79%～94%同源性，包含Trans_IPPS_HH保守结构域，可能属于Isoprenoid Biosynthesis enzymes，Class 1家族。为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。

关键词 枇杷；鲨烯合酶基因；基因克隆；序列分析

中图分类号 S667.2 文献标识码 A

Cloning and Sequence Analysis of Squalene Synthase

Gene in Eriobotrya japonica L.

LI Huihua，LIU Xiaoying，WANG Wei，CHANG Qiang，SU Minghua*

Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China

Abstract The cDNA of SQS（Squalene Synthase Gene）， which was an importent enzyme of terpenes synthesis， was cloned with RT-PCR and RACE from cell suspension culture of Eriobotrya japonica L. The full length of Ej-SQS cDNA（GenBank， JQ294055）， about 1 775 bp， consisted of an open reading frame of 1 239 bp， and 5′ and 3′ un-translated regions of 97 bp and 439 bp respectively. The putative protein had 412 amino acids， and the identity to the other polypeptides varied between 79%～94%， contained Trans_IPPS_HH conserved domains， and belonged to isoprenoid biosynthesis enzymes， class 1 family. It was the foundation of the further regulation of loquat cell suspension cultures to extract the desired product， using genetic engineering.

Key words Eriobotrya japonica L.； Squalene synthase gene； Gene cloning； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.009

枇杷（Eriobotrya japonica L.）属蔷薇科（Rosaceae）枇杷属，是原产中国东南部的一种重要的小乔木，果实在秋冬开花，春夏成熟，被称是“果木中独备四时之气者”，除此之外，叶、果、花都是传统的中药，枇杷中三萜酸类成分具有抗炎、降血糖、抗病毒以及抗癌的活性，其中熊果酸（Ursolic Acid，UA）、齐墩果酸、科罗索酸为主要的药用成分，市场十分紧缺，经济价值高[1-4]。

目前对此类化合物的生物合成途径已有一定的了解。整个代谢途径涉及众多酶促反应，其中鲨烯是三萜类、甾醇类、胆固醇类等烯萜类的共同前体，鲨烯合酶（SQS，Squalene synthase，EC2.5.1.21）是生物体中催化类异戊烯代谢途径向甾醇和三萜生物合成转化的第一个关键酶，其催化2分子的法尼基焦磷酸（FPP）尾尾缩合，形成鲨烯（SQ）[5-8]。

在甘草[9]、三七[10]、人参[11-12]等药用植物上已克隆到SQS cDNA全长序列，但枇杷上还没有SQS克隆的相关报道。利用植物细胞悬浮培养技术生产次生代谢产物是目前中药生产中极具潜力的技术路线[13-16]。本研究基于正在进行的枇杷细胞悬浮培养调控目标产物UA含量的试验，克隆枇杷三萜酸合成途径中的关键酶SQS基因的cDNA全长序列，为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采用枇杷（Eriobotrya japonica L.）品种早钟6号，其幼胚中诱导的愈伤组织经过多次继代后转液体培养，经人工调控后建立悬浮细胞系，以此为试验材料，由福建省亚热带植物研究所（厦门）细胞培养实验室保存，具体建立方法参见李惠华等[17]。试验于2011～2012年开展完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及逆转录 采用北京天恩泽公司的柱式植物RNAOUT 2.0参考试剂盒，按照说明书提取枇杷细胞悬浮培养物总RNA；采用Fermentas公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以Oligo（dT）18为引物参照说明书进行逆转录。

1.2.2 引物设计 检索数据库中已有序列，设计保守区引物；继而参考保守区测序结果及其它物种的序列设计3′ RACE以及5′ RACE巢式PCR反应的基因特异性引物；经3次扩增测序拼接后获得cDNA全长序列，据此设计用于扩增SQS的ORF（开放阅读框）序列的引物。PCR反应中涉及的引物序列见表1。

1.2.3 PCR扩增 反应体系（试剂购自TaKaRa 公司）：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L）2 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，0.2 μL Ex Taq （5 U/μL），H2O 16.3 μL，总体积为25 μL。程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 1 min、TM ℃（退火温度）1 min、72 ℃ t s（延伸时间），35个循环，72 ℃ 10 min。PCR扩增。引物、TM、t具体值见表2。

3′RACE以AP为逆转录引物，其它同方法1.2.1。5′RACE参照TaKaRa公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit的试剂盒说明书，以NUP-long为逆转录引物。巢式PCR第一轮产物做10-100倍稀释作第二轮扩增的模板。

1.2.4 TA克隆及测序 回收目的片段（Solarbio公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒），以pGEM-T（PROMEGA公司）为载体进行T/A克隆，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑阳性克隆子测序，引物合成及测序均委托华大基因公司。

1.2.5 生物信息学分析 目的基因引物设计、序列拼接及分析采用DNAMAN软件，cDNA核酸序列推导的氨基酸序列采用ExPASy ProtParam、NCBI-CDS、PSORT、TMHMM2.0、SignalP、Jpred、Coils、NetPhos 2.0、Gene Ontology annotation等在线软件进行分析，具体参考李惠华等文献中方法[17]；系统进化树建立使用MEGA 5.0软件（Neighbor-Joining，NJ方法）。

2 结果与分析

2.1 枇杷悬浮培养细胞总RNA的质量

采用1.2.1中试剂盒方法提取的枇杷悬浮培养细胞总RNA，总耗时为1 h，紫外分光测定总RNA的A260/A280为2.012，经1%琼脂糖电泳检测为完整清晰的3条带（图1-A-1），并且28 S条带亮度约为18 S条带2倍，表明此方法提取的枇杷悬浮培养细胞总RNA的质量高，可以用于后续试验。

2.2 枇杷SQS基因的cDNA全长序列的克隆

方法1.2.1中逆转录得到的cDNA第一链为模板，PCR扩增得到一条约830 bp的DNA片段，测序表明此片段长度为824 bp（图1-B-2），经GenBank上blastn和blastp表明，与苹果SQS的核酸及氨基酸序列（GenBank登录号KC895979，AGS78117）分别有97%及95%同源，初步推断此片段为枇杷SQS的cDNA部分序列。

以3′RACE逆转录得到的cDNA为模板，利用基因特异性引物P3和P4进行巢式PCR，琼脂糖（1%）电泳显示：1条约1 000 bp单一条带（图1-C-3），与预期相符，测序后确认此片段大小为1 052 bp，与保守区序列比对有44 bp的重叠片段，表明此片段是枇杷SQS的cDNA的3′末端。

以5′RACE逆转录得到的cDNA为模板，利用基因特异性引物P5和P6进行巢式PCR，电泳显示：长度约450 bp的单一条带（图1-D-4），测序后确认此片段大小为394 bp，与保守区序列比对有157 bp的重叠片段，表明此片段是枇杷胚性愈伤组织SQS的cDNA 5′端序列。

基于保守区、3′RACE和5′RACE扩增测序结果，拼接得到的枇杷SQS的cDNA全长序列，采用引物P7和P8（表2）进行了ORF的扩增，电泳表明获得长度约1.2 kb 1条清晰的DNA条带（图1-E-5），克隆测序后确定此片段为1 239 bp，包含1个完整的编码框，与拼接的cDNA全长序列的相应部分（软件预测的ORF）重叠，与拼接序列相互印证。

2.3 枇杷SQS基因的序列分析

枇杷愈伤组织SQS的cDNA序列，命名为Ej-SQS（GenBank登录号为JQ294055），全长为1 775 bp，5′末端非编码区为97 bp，3′末端非编码区为439 bp，3′poly（A）尾长14 bp，开放阅读框为1 239 bp。

2.4 枇杷SQS的生物信息学分析

生物信息学分析表明：Ej-SQS编码412个氨基酸（其中带负电的氨基酸占50.51%，带正电的氨基酸占49.49%），分子量为46.9 ku，pI 6.80，属亲水蛋白；此蛋白包含Trans_IPPS_HH保守结构域，可能属Isoprenoid Biosynthesis enzymes，Class 1家族成员；亚细胞定位在质膜中的可能性最大；在第281～303位氨基酸，由外到内，以及第386～408位，方向是由内到外，共有2个跨膜螺旋；该蛋白不是分泌蛋白，无信号肽；其主要的二级结构是α螺旋；形成卷曲螺旋的可能性低；其磷酸化位点有33个，在整条多肽链中分布非均匀。其功能为：参与脂质生物合成，为膜的组分，具有法尼基二磷酸法尼基转移酶活性及鲨烯合酶活性。

Ej-SQS的cDNA核酸序列推导的氨基酸序列（Eriobotrya japonica，GenBank AFI33135.3，蔷薇科）与百脉根（Lotus japonicus，GenBank BAC56854.1，豆科），黄芪（Astragalus membranaceus，GenBank ADW27427，豆科），大豆（Glycine max，GenBank NP 001236365，豆科），光果甘草（Glycyrrhiza glabra，GenBank BAA13084，豆科），大戟（Euphorbia pekinensis，GenBank AFT92039，大戟科），远志（Polygala tenuifolia，GenBank ABG66304，远志科），苹果（Malus domestica，GenBank AGS78118，蔷薇科），油茶（Camellia oleifera，GenBank AGB0560，茶科），青蒿（Artemisia annua，GenBank AAR20329.1，菊科），人参（Panax ginseng，GenBank ACV88718，五加科），紫胡（Bupleurum chinense，GenBank ACX42423.1，伞形科），刺五加（Eleutherococcus senticosus，GenBank AER23670.1，五加科）的氨基酸序列的同源性分别为81%、81%、85%、83%、80%、79%、94%、83%、79%、83%、79%、82%。共13条氨基酸序列构建成的系统进化树（图2），枇杷与同为蔷薇科的苹果首先聚类，同为豆科的百脉根、黄芪、大豆、光果甘草，同为五加科的人参、刺五加也处于进化树的同一个分枝或邻枝，其有着很近的进化距离，与油茶、紫胡等有着相对较近的进化关系。同时可以看出SQS基因在各物种中是很保守的。

3 讨论与结论

3.1 枇杷悬浮培养细胞在分子生物学试验中的优越性

一般来说，木本植物的RNA提取较草本植物难，枇杷材料通常采用传统SDS或CTAB法提取RNA[18]。用于RT-PCR及RACE的RNA应完整无降解，否则会导致PCR扩增特别是5′RACE的失败。本试验采用的是枇杷幼胚中诱导的愈伤组织建立的悬浮系的细胞培养物作为试验材料，因其可能少含或不含脂类、树脂类、叶绿素等成分，在核酸提取上更加简便、快捷，可以采用市面上普通的RNA快速提取试剂盒，且提取的总RNA质量高，可以直接用于后续试验。在分子生物学试验操作中，枇杷细胞悬浮培养物较其它材料有程序简化、快速、得率高的优点。这与龙眼中结果相似。以龙眼胚性愈伤组织或栽培品种龙眼为基因克隆材料得到的ACO基因的编码序列完全一致[19]。至于枇杷细胞悬浮培养物为材料克隆得到的基因与栽培的枇杷序列是否有不同，是否是枇杷目的基因分离的替代体系，需要进一步试验。

3.2 RT-PCR结合RACE的同源克隆方法较适合于枇杷SQS基因

SQS基因的克隆主要采用：①功能互补；②RT-PCR与RACE 相结合；③RT-PCR与筛库相结合。已报道的各植物之间SQS的序列同源性较高[20]，这为进行同源克隆提供了有利条件。通过试验，结果表明枇杷SQS序列与其它植物SQS具有79%～94%同源性，再次证明植物之间氨基酸序列的相似性很高。在本试验中，枇杷SQS基因的保守区、3′序列和5′序列均一次获得，目的条带均单一清晰明亮。SQS基因的同源克隆总体较为顺利，这可能与SQS的高度保守性有关，也可能与在枇杷悬浮培养细胞中的高丰度的表达有关。今后其它植物中SQS基因的克隆可以首先考虑RT-PCR与RACE相结合的方法。

3.3 今后枇杷SQS基因的若干研究方向

SQS在多种植物中超表达能够明显提高植物甾醇和三萜类物质的含量。例如：人参中鲨烯合成酶的过量表达可以提高其药用成份三萜皂苷的含量[21]。蒋世翠[22]研究也发现西洋参中SQS和SQE基因的表达具组织特异性，并且基因的表达量与人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd以及总皂苷的含量之间呈现出正相关。灵芝中灵芝三萜的产量多少与鲨烯合酶基因的表达以及酶活性密切相关，变化相符[23]。

本试验克隆分离枇杷三萜类化合物的合成途径中的关键酶SQS基因的cDNA序列，今后在此基础上可以研究SQS基因的表达情况与三萜类化合物合成的相互关系，开展SQS基因功能研究，为今后通过人工调控枇杷细胞工程规模化生产枇杷五环三萜化合物奠定基础，同时也为枇杷基因改良提供基因源。

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责任编辑：叶庆亮