海南木豆丛枝植原体质粒全序列测定及分析

李玲婷等

摘 要 提取木豆叶片基因组总DNA，通过克隆，测序木豆丛枝植原体海南株系质粒（pPPWB-Hn）的完整DNA序列，并使用生物信息学软件对该质粒全长序列进行分析。分析结果显示：pPPWB-Hn质粒全长4 218 bp，含有4个开放阅读框，分别编码Rep、dnaG、threonine synthase和未知蛋白。其中，Rep是2次跨膜蛋白，dnaG是单次跨膜蛋白，Rep和dnaG均与质粒自主复制有关。Rep和未知蛋白可能分布在细胞质中，dnaG可能定位到细胞膜上或膜外，Threonine synthase可能定位到线粒体膜上或线粒体内腔。系统进化树显示：pPPWB-Hn与植原体16SrⅡ组的pPNWB（AY270152），pTBBperi（DQ119297）及pTBBcap（DQ119296）处在同一进化分支。

关键词 木豆丛枝植原体；质粒；序列分析

中图分类号 S432.42 文献标识码 A

Abstract The complete nucleotide sequence of plasmid from pigeon pea witches-broom phytoplasma has been determined. The plasmid， pPPWB-Hn， was 4 218 bp in length and contained 4 putative ORFs. ORF1 encoded a replication protein（Rep）with two transmembrane domains. ORF2 encoded dnaG with a single transmembrane domain. ORF3 encoded threonine synthase， and ORF4 encodedan unknown function protein. Threonine synthase and unknownprotein are not transmembrane protein. The Rep and dnaG were relatively to autonomous replication of the plasmid. The Rep， dnaG， threonine synthas and unknownprotein were presumably to be localized to thecytoplasm， the membrane or cytoplasm， the mitochondrial membrane or mitochondrial cavity， and cytoplasmrespectively. The phylogenetic tree showed that the sequence was clustered in the same clade with pPNWB（AY270152）， pTBBperi（DQ119297）and pTBBcap（DQ119296）， which belonged to 16Sr IIgroup phytoplasma。

Key words Pigeon pea witches'-broom phytoplasma； Plasmid； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.026

木豆[Cajanus cajan（L.）Millsp.]又名三叶豆、鸽豆、树豆，是一种重要的经济作物和粮食作物[1-2]。在中国木豆主要种植在云南、广西、海南等地，用于喂养家畜和家禽，枝条可作为柴薪，提取物可制成药物[3-6]。木豆丛枝病是由植原体引起的一类世界性病害，防治困难，美国的佛罗里达洲，加勒比海地区、牙买加等地种植的木豆均受到该病的侵害[7-8]。中国学者1986年在海南儋县发现表现丛枝症状的木豆植株，通过电子显微镜观察到植原体的存在，通过对木豆丛枝植原体16S rDNA和rp基因的分析，确定引起海南木豆丛枝的植原体属于16S rⅡ组中的亚组ⅲ[9-10]。目前除台湾、海南外，中国尚未见其它地区有关于木豆丛枝病的研究报道。

质粒是一种可以自我复制的染色体外DNA分子，1988年首次在玉米丛缩病植原体中发现质粒[11]，目前已在20多种植原体中发现质粒的存在，近年的研究发现，质粒可能在植原体进化，种群多样性，致病性等方面发挥重要作用，也与植物双生病毒间存在一定的进化关系，植原体质粒研究已成为植原体致病性研究不可缺少的一部分[12-16]。本研究测定了木豆丛枝植原体的一个完整质粒序列，并利用生物信息学分析对其编码的蛋白结构及功能进行预测，为进一步研究该质粒功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

木豆丛枝病样品采自海南儋州，感病木豆植株明显矮化，节间缩短，叶片变小，丛生，该病害由海南木豆丛枝植原体（Hainan pigeon pea witches'-broom， PPWB-Hn）引起[17]。

1.2 方法

1.2.1 木豆叶片基因组总DNA提取 采用天根生物工程有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，根据试剂盒操作说明提取木豆基因组DNA。

1.2.2 植原体质粒的克隆 根据已发表的植原体16SrⅡ组质粒Peanut witches'-broom phytoplasma plasmid pPNWB（登录号：AY270152）和Tomato big bud phytoplasma plasmid pTBBcap（登录号：DQ119296）序列同源性比对结果，设计PCR扩增引物M-11（5′-TGCGTCGTGGTCATCGTAGT-3′）/M-12（5′-GGGCG

ATAAGGTAATTCTGC-3′）。以表现丛枝症状的木豆叶片基因组DNA为模板扩增获得植原体质粒片段。

木豆丛枝植原体质粒第1次PCR反应采用TaKaRa Taq进行。反应体积25 μL，内含DNA样品1 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）5 μL，上、下游引物（浓度均为10 μmol/L）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.3 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。第2次PCR反应采用TaKaRa LA Taq进行。反应体积25 μL，内含DNA样品1 μL，10×LA PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL，上、下游引物（浓度均为10 μmol/L）各1 μL，LA Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.25 μL，ddH2O 15.25 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。第1次及第2次PCR产物均在1%琼脂糖凝胶电泳中电泳30 min，经Goldview染色，在凝胶成像系统中观察并拍照。

PCR扩增出的目的DNA片段由TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0纯化回收后克隆入pMD18-T载体，转化E.coli Competent Cell DH5α，利用蓝白斑筛选阳性克隆，用PCR反应检测阳性克隆，序列测定委托上海立菲生物技术有限公司完成。

1.2.3 序列分析 序列装配及特征简析利用DNAman分析软件，开放阅读框预测采用NCBI网站的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），序列同源性比较分析采用NCBI网站的BLAST（Basic Local Alignment Search Tools）工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），串联重复序列分析使用RepeatMasker程序（http：//www.repeatmasker.org/），跨膜区预测使用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/），亚细胞定位使用TargetP 程序预测（http：//www.cbs.dtu.dk/）。系统进化树分析采用MEGA4.0.2，

2 结果与分析

2.1 pPPWB-Hn的克隆及分子特征

2.1.1 pPPWB-Hn的克隆 以表现丛枝症状的木豆叶片基因组DNA为模板，用引物M-11/M-12进行第1次PCR扩增获得长度1 189 bp的片段pPPWB-Hn F1（图1），根据pPPWB-Hn F1片段的序列设计反向PCR引物NM-1（5′-CCACTAAATAAGATGC

CTGAAA-3′）/NM-2（5′-GCCGTATTATGCGGTAGAT

T-3′）进行第2次PCR扩增，获得长度3 383 bp的片段pPPWB-Hn F2（图2），将2条末端重叠的片段pPPWB-Hn F1和pPPWB-Hn F2使用DNAMAN6.0进行序列拼接装配，最终得到长度4 218 bp的环状质粒，命名为pPPWB-Hn（GenBank登录号：KC935372）。

2.1.2 pPPWB-Hn的分子特征 pPPWB-Hn序列中A+T占72.85%，用NCBI网站BLAST进行同源性分析可知pPPWB-Hn和pPNWB有97.82%的同源性，与pTBBcap有95%的同源性。串联重复分析发现pPPWB-Hn含有2个简单重复序列，第1个位于ORF3和ORF4之间的非编码区（2 912～2 931 bp），长度为20 bp（AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA），第2个也位于ORF3和ORF4之间的非编码区（3 618～3 637 bp），长度为20 bp（TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT）。

用NCBI的ORF Finder分析可知，质粒一共有4个编码大于100个氨基酸的开放阅读框，其中ORF1、ORF2、ORF4的方向一致，ORF3与上述3个开放阅读框方向相反（图3）。将pPPWB-Hn编码的4个蛋白氨基酸序列利用NCBI网站的protein BLAST进行（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比较，ORF1与pPNWB编码的Rep蛋白同源性最高，达到95%，ORF2与pPNWB编码的dnaG蛋白同源性最高，达到99%，ORF3与pPNWB编码的苏氨酸合成酶（Thr synthase）蛋白同源性最高，达到100%，ORF4与pPNWB编码的一个未知蛋白同源性最高，达到88%（表1）。

2.2 pPPWB-Hn编码的蛋白跨膜结构预测

使用TMpred程序对序列编码的4种蛋白进行跨膜区预测（http：//www.ch.embnet.org/），结果表明，ORF1编码的Rep蛋白具有1个从膜外向膜内的跨膜区（AA：249～273）和1个从膜内向膜外的跨膜区（AA：334～353）；ORF2编码的dnaG蛋白是个单次跨膜蛋白（AA：292～308），且N端位于膜外侧；ORF3编码的Threonine synthase和ORF4编码的未知蛋白没有跨膜区出现。

2.3 pPPWB-Hn编码的蛋白亚细胞定位预测

使用TargetP 程序预测亚细胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/），见表2所示，4种蛋白都不含叶绿体定位信号，ORF1编码的Rep和ORF4编码的未知蛋白不含线粒体定位序列及信号肽序列，可能分布在细胞质内，ORF2编码的dnaG含有信号肽序列，信号值为0.891，可能进入分泌途径定位到细胞膜上或膜外，ORF3编码的Threonine synthase含有线粒体定位信号肽，信号值为0.764，可能定位到线粒体膜上或线粒体内腔（表2）。

2.4 系统进化树分析

从系统进化树可以看出：pPPWB-Hn与植原体16SrⅡ组的pPNWB（AY270152），pTBBperi（DQ119297）及 pTBBcap（DQ119296）处在同一进化分支（图4）。

3 讨论与结论

质粒数目和大小在不同植原体中均不相同，已报道的最大植原体质粒为叶蝉传甜菜绿化植原体质粒（pBLTVA-1），大小为10 785 bp，最小的质粒为叶蝉传甜菜绿化植原体质粒（pBLTVA-2），大小为2 587 bp，大多数植原体质粒序列长度在3 000 ～5 000 bp之间[16]。本研究测定了中国木豆丛枝植原体海南株系一个质粒pPPWB-Hn的完整DNA序列，其大小为4 218 bp，利用生物信息学软件预测该质粒编码4个蛋白，除包括所有植原体都含有的与质粒复制有关的Rep蛋白外，还包括1个DNA 引物酶蛋白（dnaG）、1个苏氨酸合成酶蛋白和1个未知功能的蛋白。对质粒的系统进化分析表明，pPPWB-Hn与16SrⅡ组植原体质粒处在同一进化分支，这与根据16S rDNA进行的植原体分类结果一致[10]，这表明除了利用16S rDNA序列对植原体进行分类外，质粒序列也可作为植原体分类的依据。

目前，NCBI上已公布的植原体质粒全序列有80多个，但多数是16SrⅠ组成员，植原体16SrⅡ组质粒仅有pPNWB、pTBBcap和pTBBperi等公布。pPPWB-Hn与pPNWB相比：ORF1少84个碱基，全序列长度相近，ORF数量、编码的蛋白功能和表达方向均相同；pPPWB-Hn与pTBBcap、pTBBperi相比差异较大：pTBBcap仅3个ORF，ORF的位置和大小差别较大，pPNWB质粒Rep基因的大小差不多是pTBBcap和pTBBper的2倍，这可能和寄主植物、介体昆虫及地理生态环境有关。关于木豆丛枝植原体体内是否还存在其它质粒以及植原体质粒在病原与寄主植物互作中的作用还有待进一步研究。

参考文献

[1] Ahlawat I P S， Gangaiah B， Singh I P， et al. Pigeon pea（Cajanus cajan）research in India-an overview[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences， 2005， 75： 309-320.

[2] 郑作杰. 中国食用豆类学[M]. 北京： 中国农业出版社， 1997： 306-327.

[3] 王 鹏， 任顺成， 王国良. 常见食用豆类的营养特点及功能特性[J]. 食品研究与开发， 2009， 30（12）： 171-174.

[4] 王彩云. 豆类的营养价值和加工技术[J]. 西部粮油科技， 2001， 26（4）： 33-34.

[5] 李正红， 周朝鸿， 谷 勇. 中国木豆研究利用现状及开发前景[J]. 林业科学研究， 2001， 14（6）： 674-681.

[6] 吕福基， 袁 杰， 李正红. 木豆籽实饲喂肉猪研究[J]. 饲料工业， 1995， 16（7）： 29-31.

[7] Hirumi H， Maramorosch K， Hichez E. Rhabdovirus andmycoplasmalike organisms： natural dual infection of Cajanus cajan[J]. Phytopathology， 1973， 63： 202

[8] Maramorosch K， Hirumi H， Kimura M， et al. Diseases of Cajanuscajan in the Caribbeanarea： anelectron microscope study[J]. FAO Plant Protection Bulletin， 1974， 22： 32-36.

[9] 陈作义， 沈菊英， 彭宝珍， 等. 五种豆科牧草丛枝病病原电镜观察[J]. 上海农业学报， 1986， 2（2）： 49-56.

[10]车海彦， 罗大全， 符瑞益. 海南省木豆丛枝病植原体的分子检测及鉴定[J]. 植物病理学报. 2010， 40（2）： 113-121.

[11] Davis M J， Tsai J H， Cox R L， et al. Cloning of chromosomal and extrachromosomal DNA of the mycoplasmalike organism that causes maize bushy stunt disease[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions. 1988， 1： 295-302.

[12] Panopoulos N J， Peet R C. The molecular genetics of plant pathogenic bacteria and their plasmids[J]. Annual Review of Phytopathology. 1985， 23： 381-419.

[13] Vivian A， Murillo J， Jackson R W. The roles of plasmids in phytopathogenic bacteria： mobile arsenals[J]. Microbiology. 2001， 147： 763-780.

[14] Toruno T Y， Musi M S， Simi S， et al. Phytoplasma PMU1 exists as linear chromosomal and circular extrachromosomal elements and has enhanced expression in insect vectors compared with plant hosts[J]. Molecular Microbiology. 2010， 77： 1 406-1 415.

[15] Nishigawa H， Oshima K， Kakizawa S， et al. Evidence of intermolecular recombination between extrachromosomal DNAs in phytoplasma： a trigger for the biological diversity of phytoplasma？[J]. Microbiology， 2002， 148： 1 389-1 396.

[16] Lin C L， Zhou T， Li H F， et al. Molecular characterisation of two plasmids from paulowniawitches'-broom phytoplasma and detection of a plasmid-encodedprotein in infected plants[J]. European Journal of Plant Pathology， 2009， 123（3）： 321-330.

[17]车海彦， 罗大全， 符瑞益， 等. 海南省木豆丛枝病植原体的分子检测及鉴定[J]. 植物病理学报， 2010， 40（2）： 113-121.