橡胶树AGPase一个大亚c基DNA全长克隆及表达分析

郑乾坤等

摘 要 ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成起始的关键酶，利用保守序列设计简并引物，得到一条橡胶树AGPase大亚基的类似序列，再以木质部cDNA为模板通过RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术克隆得到AGPase基因的cDNA全长，命名为HbLSUI（GenBank NO：KJ020930）。生物信息学分析结果表明，AGPase基因所编码的蛋白具有AGPase大亚基保守结构域。RT-PCR表达分析结果表明，AGPase基因在木质部和树皮中的表达量较高。利用荧光定量PCR分析AGPase基因在不割胶、常规割胶和乙烯刺激割胶3种割胶强度下的表达情况，结果表明，割胶和刺激割胶可导致该基因的表达量降低。

关键词 橡胶树；AGPase；淀粉；定量PCR

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Cloning of One Full-length AGPase Large

Subunit cDNA Sequence and Expression Analysis

ZHENG Qiankun1， WEI Fang2， LUO Shiqiao2，

WU Ming2， QIU Jian2， YANG Wenfeng2， XIAO Xianzhou1，2*

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ADP glucose pyrophosphorylase（AGPase）is a key enzyme to the process of starch synthesis. In this research， one cDNA sequence of AGPase large subunit was isolated from rubber tree xylem by RACE（rapid amplification of cDNA ends）technique， named HbLSUI（Genebank NO：KJ020930）. Bioinformatic analysis showed that HbLSUI had the conserved domains of AGPase large subunit. Semi-quantitative PCR indicated the transcripts of HbLSUI was abundant in xylem and bark. Quantitative PCR indicated： tapping and ethylene stimulate tapping reduced the transcript levels of HbLSUI significantly.

Key words Hevea brasiliensis；AGPase；Starch；Quantitative PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.013

淀粉是高等植物中主要的贮藏碳水化合物，是植物中最丰富和最重要的储备多糖，是能量来源最重要的物质之一。巴西橡胶树是一种产胶植物，橡胶合成的前体分子是蔗糖，而蔗糖可由淀粉降解而来，因此，淀粉与橡胶合成之间存在一定的相关性。但由于淀粉并不是合成橡胶的直接原材料，关于橡胶树中淀粉代谢方面的研究较少。近年来发展起来的刺激割胶大幅度地提高了橡胶的产量，但由于割胶强度较大，不可避免的需要动员储藏碳库来供应原料供应，这个过程中淀粉的作用不可忽略。

植物在进行光合作用时，除了产生满足当前需要的碳水化合物外，剩余的碳水化合物被植物储藏用于代谢系统的维护和再生[1]。作为光合作用最重要的终产物，淀粉被运输到所需的各个组织和器官，但大多数是作为储存性的物质储存以备动用，特别是在光合作用不足以满足生长和发育需求的时候，植物就会动用它自身储存的非结构性多糖[2]。在一些特定的情况下，如植株遭受伤害或者阔叶植物早春生长时，橡胶树由于割胶和强度割胶时，此时光合作用的即时供应满足不了植株需求，储藏物质被动员起来用于支持植物度过高能量消耗期[3]。

淀粉在动员之前需要先完成淀粉的积累过程，淀粉的合成是个复杂的过程，而ADP葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）是淀粉合成起始的关键酶，淀粉合成关键步骤是ADP-葡萄糖在AGPase催化下的合成[4]。ADP-葡萄糖在植物的光合组织和非光合组织中都具有重要的作用[5]。ADP-葡萄糖是葡萄糖基的供体，也是合成淀粉的底物。在真核生物中，AGPase是由2个不同的亚基组成的四聚体，包括2个大亚基和2个小亚基蛋白。在许多作物中，如菠菜、马铃薯、甘薯、西红柿、小麦、鹰嘴豆、水稻、玉米、柑橘的AGPase的亚基基因均已被克隆，并且有很多已经做了表达分析[6-16]。AGPase的基因功能与淀粉合成也有一定的关联，姚庆荣等[17]将该基因转化得到了转基因的烟草，并获得了淀粉含量较高的转基因烟草。Smidansky等[18]将玉米的AGPase基因转入小麦中，结果获得了籽粒和生物量都增加的转基因小麦。

目前，有关橡胶树AGPase基因在分子生物学方面的研究还处于空白。本研究从巴西橡胶树中克隆得到一条AGPase大亚基基因的cDNA序列，命名为HbLSUI，并对该基因的表达特征进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

基因全长克隆以开割后PR107品种的橡胶树木质部作为材料，组织特异性分析采用橡胶树的不同组织（分别是橡胶树的木质部、树皮、叶片、胶乳和根）作为实验材料提取RNA。

不同割胶强度下的材料取样方法：在试验场七队选取开割后的橡胶树，品种为PR107，于1982年定植，1990年开割。选取3组橡胶树分别作为对照、常规割胶和刺激割胶，每组3个重复，对选取的橡胶树不割胶处理3个月，9月开始取样，取割线下方2～3 cm处的树皮和木质部样品作为实验材料提取RNA。经过2个月的常规割胶（1/2 s，3 d）和乙烯刺激割胶（1/2 s，3 d+ET），11月再次取割线下方2～3 cm处的树皮和木质部样品作为实验材料提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取与反转录 RNA的提取采用百泰克RNA提取试剂盒提取（具体方法参照说明书）。反转录是利用Ferments反转录试剂盒完成（具体方法参照说明书）。

1.2.2 利用RACE技术克隆大亚基基因 利用AGPase简并引物（SenseP和AntiP）克隆部分序列，通过RACE技术扩增基因全长，接头引物为UMP和NUP，正向引物为5′GSP和5′NGSP，反向引物为3′GSP和3′NGSP（表1）。得到的电泳序列经过凝胶回收试剂盒（Axygen，KE10101003-G）纯化回收后连接到pEASY-T1（Transgen）载体上，并送北京华大基因测序。

1.2.3 生物信息学分析 等电点分子量预测：利用在线（http：//web.expasy.org/compute_pi/）工具预测该基因表达蛋白的等电点；亚细胞定位：利用在线的（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）singalP工具对该基因表达的蛋白进行定位预测；功能域预测：利用ncbi（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）工具对该基因的结构域进行了预测和比对。

1.2.4 表达分析 分别提取橡胶树木质部、树皮、叶片、胶乳和根的RNA，通过RT-PCR得到cDNA模板，以18S rRNA（GenBank登陆号：AB268099）（引物：18S-FP、18S-RP）作为内参基因调节模板浓度，通过半定量PCR法分析不同组织中该基因的表达情况，半定量的最佳循环数为26个循环。利用荧光定量PCR法分析HbLSUI在不同割胶强度下（对照、常规、刺激）的表达情况。利用重复不等随机单因子的分析方法对其差值做差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 RACE结果及序列分析

克隆得到一条AGPase大亚基基因序列，经过测序，其全长为1 696 bp（GenBank登录号：KJ020930），预测编码527个氨基酸，5′-UTR有59 bp，3′-UTR有53 bp，理论预测推导氨基酸分子量为58.399 ku，等电点为7.18。通过SignalP分析，该推导序列定位在细胞质中，属于胞质型大亚基。该基因序列编码的蛋白序列与蓖麻、杨树的序列有较高的同源性，分别为89%和86%（表2）。

HbLSUI推导的氨基酸序列见图1，与已经鉴定功能的玉米（ZmLSU，GenBank NO：S48563）保守结构域[13]的比较分析，结果表明该推导序列包含AGPase大亚基的5个功能区序列，横线部分依次是：191～199：ATP结合区（ATP-binding motif）；222～231：催化区（Catalytic motif）；271～280：GTP结合区（GTP-binding motif）；376～429：亚基结合区（Between-subunit interaction motif）；511～527：调控区（Regulation motif）。初步证明推导的氨基酸序列具有AGPase大亚基蛋白的功能。

2.2 HbLSUI基因的表达模式分析

虽然HbLSUI基因从木质部中克隆得到，但该基因在不同组织中均有表达。由图2可以看出，HbLSUI基因在不同组织中的表达情况不同，在木质部、树皮中的表达量比在叶片、胶乳中的表达量高。

2.3 割胶对HbLSUI基因表达的影响

为了更深入的了解淀粉在树皮和木质部的合成，分别在割胶和刺激割胶条件下，研究HbLSUI基因的表达分析情况。通过荧光定量PCR，得到HbLSUI在转录水平对于不同割胶强度的反应，由于树皮与木质部中淀粉的积累情况区别较大，因此，本研究对2个部位分别进行了分析。

由图3可以看出，在木质部中，9月实验前HbLSUI的表达量显著高于11月实验后的表达量。经过11月常规割胶和刺激割胶后，HbLSUI的表达量比对照明显降低。

为了排除物候的影响，本研究选取前后2次取样的结果，利用重复不等随机单因子的分析方法对其差值做差异显著性分析，结果表明，刺激割胶和常规割胶下，木质部中该基因的表达量显著低于对照（图3）。在树皮中，刺激和常规割胶下，HbLSUI的表达量也显著降低（图4），与木质部的表达结果吻合。

3 讨论与结论

橡胶树淀粉的消长规律是重要的割胶理论基础，包括合成和降解2个过程，淀粉的合成是一种正向的积累碳源的过程，对其进行研究有助于更好地理解消长规律。AGPase是淀粉合成过程的关键酶，该研究通过RACE技术从橡胶树木质部克隆得到一个AGPase大亚基基因的cDNA全长序列（HbLSUI），经过比对发现与其同科的蓖麻同源性较高， 属于胞质型大亚基， 与已报道的玉米、柑橘、毛果杨[12-13]等大亚基基因的结构域相似，具有AGPase大亚基蛋白的5个功能区。

HbLSUI在木质部和树皮中的表达量较高，而在叶片中的表达量较低，这种表达模式与其他植物不同。大多数植物AGPase的组织特异性表达表现为叶片表达高，如康国章等[9，19]在对小麦的研究中发现AGPase大亚基基因在小麦的叶片中表达量最高，茎和根表达量相对较低；类似的研究在木本植物柑橘[12]和鹰嘴豆[4]的研究中也得到证实。推测该基因在橡胶树中的表达具有特异性，在木质部和树皮中的表达较其他组织活跃。

在树皮中，淀粉作为即时的缓冲；木质部中，淀粉可以看做一种长效储藏源[19]，淀粉在2个部分的作用不同。HbLSUI表达受物候影响较大，包括对照在内，不同强度割胶下，木质部中HbLSUI基因在9月和11月的表达量发生了显著变化，9月的表达量显著高于11月的。9月光照充足，光合作用旺盛，橡胶树处于代谢旺产期，11月气温降低，光合作用减弱，淀粉合成减慢；这种状况同样出现在树皮中，可见木质部和树皮中淀粉合成与HbLSUI有关。常规割胶和刺激割胶对树皮和木质部中HbLSUI转录水平都产生了影响，差异显著性分析结果表明，割胶引起HbLSUI的表达比对照降低，而且割胶强度大的刺激割胶处理降低程度更大，分析原因，推测是割胶伤害对表达产生了影响，组织细胞学研究结果表明，持续割胶导致割面最近处胶乳再生区的树皮软组织淀粉短缺[20]，Junjittakarn等[21]认为割胶引起的短期效应导致碳源的局部沉默，由于本研究取样部位是割线附近，也可能是持续伤害仅对割线处HbLSUI的表达产生负面影响。割胶引起HbLSUI的表达降低，而Silpi等[22-23]在对橡胶树树干的研究中认为，割胶引起了树干淀粉的积累，在割面上部离割面越近积累效果越显著，鉴于以上研究，割胶对于淀粉的合成存在促进还是抑制作用，有待进一步讨论。

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责任编辑：黄东杰