cDNA睞FLP技术及其在基因差异表达中的应用

王超 曲晓军 崔艳华

摘要cDNAAFLP技术是一种在转录水平上研究基因差异表达的分子生物学实验技术，由于其具有起始材料量少、假阳性低、重现性、灵敏度高且不需预先知晓序列信息等优点，被广泛应用于各类生物差异表达基因的研究。

关键词cDNAAFLP；基因差异表达；技术特点；应用

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）21-06937-04

cDNAAFLP Technology and Its Application in Gene Differential Expression

WANG Chao， CUI Yanhua et al （School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract cDNAAFLP is a kind of molecular biological experimental technology which detects differential expression of genes at the transcriptional level. Due to its little material， low false positive， high repeatability， high sensitivity and less sequence information is widely used in various types of studies of biological gene differential expression. The basic principle， development history， technical characteristics and the potential application of cDNAAFLP technology in lactic acid bacteria fermentation was discussed.

Key words cDNAAFLP； Differential gene expression； Technical characteristics； Application

基金项目国家自然科学基金资助项目（30901048）。

作者简介王超（1989- ），女，黑龙江佳木斯人，硕士生研究生，研究方向：分子微生物学。*通讯作者，副教授，博士，博士生导师，从事分子微生物学方面的研究。

收稿日期20140623基因的差异表达是调控细胞生命活动的核心机制[1]。目前，在转录水平上，对差异表达基因进行筛选分析的方法主要包括Northern杂交、基因芯片技术（DNA chip technique）、消减杂交（subtractive hybridization）、差示筛选（differential screening）、mRNA差异显示PCR（Differential Display Reverse Transcription PCR，DDRTPCR）、DNA微阵列（microarray）分析、基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）及cDNAAFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism，cDNAAFLP）等。其中基因芯片技术、SAGE和cDNAAFLP可对生物体转录组进行大规模全面系统分析。基因芯片是当前确定基因差异表达的常用技术之一，但利用该技术的前提条件是熟悉所研究对象的遗传背景，同时该技术对于低丰度的基因往往难以检测。另外该技术需要昂贵的设备和高昂的试验成本，一般实验室难以完成。

cDNAAFLP技术可以对未知基因组序列的生物进行基因差异表达研究。该技术最早广泛用于植物基因差异表达研究，与基因芯片技术相比，cDNAAFLP技术操作简单、不需要特殊仪器设备、成本相对低廉，且该技术的灵敏性和特异性可与基因芯片技术相比拟[2]。近年该技术不断改进和完善，已成功用于巴西固氮螺菌、鼠李糖乳杆菌等多种微生物的基因研究[3-4]。cDNAAFLP技术在基因差异表达研究中日益显示其显著地优势，笔者就cDNAAFLP技术的基本原理、发展历史、技术特点以及该技术在植物、微生物等领域的应用进行阐述，并对该技术在微生物研究中的应用前景进行了展望。

1cDNAAFLP技术的发展历史与基本原理

cDNAAFLP技术是由AFLP（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术发展而来。AFLP技术由荷兰Keygene公司的Zabeau和Vos等于1992年创建[5]，是RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）技術和PCR技术相结合的产物。RFLP基本原理是由于DNA突变增加或减少了某些内切酶位点，在限制性内切酶作用下，产生大小不等的片段，从而反映出不同样品DNA水平上的多态性。cDNAAFLP技术将RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）和AFLP [5]技术相结合，研究基因的差异表达。

cDNAAFLP的试验流程大致可分为4步：①模板的制备和cDNA的合成。以纯化的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA；②双链cDNA片段双酶切和人工接头的连接。用识别序列分别为6和4 bp的2种限制性内切酶，酶切双链cDNA。获得的酶切片段与人工接头连接；限制性内切酶的选择主要取决于酶切位点出现的频率；③酶切片段的预扩增和选择性扩增。利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增；④聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，从而确定差异基因 [6-8] （图1）。

1996年BACHEM等[6]首次应用cDNAAFLP技术研究了土豆块茎形成过程中的基因表达过程。研究者研究了储存蛋白Patatin和编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因转录水平的表达变化。分析结果与Northern分析的结论一致，证实了cDNAAFLP研究发育调控基因的可行性。同年，MONEY等[9]首次在小麦上应用了该技术，说明cDNAAFLP技术具有广泛的应用范围。1998年BACHEM等[10]深入研究了cDNAAFLP技术的影响因素，分析了PCR循环数目及模板稀释水平对反应的影响，检测了扩增中Mg2+浓度的影响作用。此方法最早应用于植物中[3]，目前国内外已应用于罗萨花、水稻、番茄、红花、棉花[11-15]等植物抗旱性、耐盐性、抗病虫性、发育不同时期基因表达等的研究。随着该技术的完善和发展，近年来该技术也应用于动物、微生物等方面研究，如用于昆虫基因表达差异性研究等[16]。HENRIQUEZ等[17]使用消减杂交和cDNAAFLP结合的方法鉴定和克隆参与马铃薯和马铃薯晚疫病菌之间相互作用而差异表达的基因，在分析细菌的基因表达图谱方面取得了一定成果。

图1cDNAAFLP试验流程42卷21期王 超等cDNAAFLP技术及其在基因差异表达中的应用2cDNA –AFLP技术特点

2.1重复性好，假阳性低，可检测低丰度表达的mRNAcDNAAFLP对PCR模板和条件的要求不高，一般用2个选择性碱基即可得到较稳定的差异片段。如果增加1个选择性碱基，可进一步减少扩增出片段的假阳性。因试验中经过2次PCR扩增，表达量较低的mRNA也易被检测出来，大大提高了反应的灵敏性[18]。当高通量测序不可用时，用改进的、成本效益好的cDNAAFLP探讨转录获得的产品。虽然高通量测序成本正在减少，往往对于个体项目目标成本仍較高，如在非模式生物全基因组转录的研究中。要排除重复的PCR，克隆和广泛存在重叠的转录，这些都会降低方法的效率[19]。

2.2反映基因之间表达量的区别cDNAAFLP技术由于其反应条件的严谨性，扩增产物的水平依赖于单个模板的浓度，故可对基因组的表达量呈现一个可靠的结果[6]。LI等[3]采用cDNAAFLP技术检测与固氮螺菌细胞趋化和包囊有关基因表达的差异，结果显示3个不同的TDFs（AB46，AB58和AB63）与聚羟基丁酸酯解聚酶的C 末端、细胞形状决定蛋白质及鞭毛域蛋白存在同源性。11个TDFs显示与信号转导蛋白存在同源性，这些信号转导蛋白包括与氮调节蛋白NtrY同源的蛋白及硝酸盐/亚硝酸盐反应调节蛋白，这些基因表达量之间的差异被准确反映出来。

2.3全面获取转录组的表达信息据推测，植物基因组中可编码16 000～33 000个基因。若选择合适的酶切组合进行分析，几乎所有的表达基因包括表达量极低的基因均可用cDNAAFLP技术检测到。一般cDNAAFLP扩增片段的大小在100～1 000 bp，平均每对引物能扩增出约50条谱带。因此，利用一对合适的内切酶组合和256对引物即可得到约13 000条带，所提供的信息量大，对于生物某个特定组织或者发育阶段而言，能够较全面地获取转录组的信息。SILVA 等[20]采用cDNAAFLP分析揭示了植物黄单胞菌全基因组。

2.4分析样品所需量少预扩增过程为选择性扩增提供了大量充足的模板，这也是cDNAAFLP只需要很少起始材料即可进行的原因。且cDNAAFLP所用的原始材料量极少，每份样品100～200 mg，便可进行cDNAAFLP的饱和筛选，即便是较难获得样品的组织如花粉粒、线粒体、叶绿体等也能适用。用AFLP分析DNA时，需要有3个选择性碱基[5]，而cDNA相对简单，利用2个选择性碱基即可。这大大扩大了cDNAAFLP技术的适用范围，这也是该技术得以广泛应用的重要原因之一。

3cDNAAFLP技术的应用

3.1基因的表达与调控研究研究者通过cDNAAFLP技术研究基因不同时空的表达情况，降低了经典mRNA差异显示技术的假阳性，同时对低水平表达基因更敏感，并使操作更安全。

LEYMARIE等[21]研究大麦种子休眠和非休眠胚胎的差异表达从而阐明休眠的分子调控机制。研究发现，39个TDFs差异表达，其中25个被克隆和测序。8个在后熟过程中差异表达，其中7个下降，可能是由于后熟降解。确定其中一个转录表达片段hv13b与果糖6磷酸2激酶/果糖2，6二磷酸酶具有同源性，可能对于维持休眠大麦或者其他可能谷物有作用。BOTTON等[22]研究炭黑曲霉生产的赭曲霉毒素，对2株炭黑曲霉进行了cDNAAFLP差异显示筛选，结果表明，抑制菌种生产能力的基因包含 119个差异表达序列，这些差异序列不同程度地参与赭曲霉毒素生物合成的调节。LIN等[23]研究发现对于苜蓿中华根瘤菌碱性应力和钾运输调控所必须的ABC载体，揭示了7个基因簇中前4个基因编码假定的糖转运三磷酸腺苷结合盒（ABC）载体的特征组分。存在钾时，根瘤菌中调控钾吸收的3个基因的转录，trkH，kdpA和kupI，在supA突变体中表达明显减弱。BOVE等[4]研究奶酪中的鼠李糖乳杆菌的转录反应。利用3对引物检测该菌在MRS培养基中64个基因的表达及该菌在奶酪培养基中96个基因的表达。cDNAAFLP方法能够证明鼠李糖乳杆菌很大一部分基因表达的变化。这是第一次通过cDNAAFLP技术从奶酪和少数有关细菌转录分离得到的鼠李糖乳杆菌。

3.2分离特异表达基因分析基因表达的差异，寻找分子标记的最终目的是为了分离基因以及研究该基因对于生物体个体发育的影响。

DELLAGEI等[24]采用cDNAAFLP分析原核植物软腐病病原菌差异表达的基因，结果表明，在蛋白质水平，这些基因与油菜黄单胞菌无毒基因有很大的相似性。Northern分析确认扩增片段的差异片段均来自差异表达的基因。CAMPALANS等[25]鉴定脱水杏仁差异表达的基因，分析了对脱水杏仁强烈响应的几个基因。预测的多肽与蛋白质序列表现出相似性，包括含氮化合物的转运、1酰基sn甘油3磷酸酰基转移酶、低分子量热休克蛋白、半胱氨酸蛋白酶和组成富含脯氨酸蛋白的表达。VALVERDE等[26]揭示了固氮螺菌2种菌株在细胞聚集过程中差异表达的相关基因，在高碳氮比诱导下，菌种在指数生长期有81个TDFs差异表达。将差异片段进行测序和分析，通过RTPCR比较野生型Sp7和 Sp72002菌株（含有一个能诱发flca-突变的TN5，不聚集，不区分运动，囊肿样，在其细胞表面缺乏一些多糖），获得了编码10种已知蛋白质基因的表达情况。

3.3毒性、耐受性研究cDNAAFLP技術可以应用于植物抗性品系和敏感品系在转录组学上的比较，筛选抗病虫害的基因，研究结果可以帮助阐明抗性品系的分子机制，以应用于抗病育种研究中。SZCZESNY等[27]采用该技术研究了植物病原细菌——黄单胞菌分泌系统Xcs和Xps的功能特性。转录分析表明，Xcv（植物病原菌中的xpst2s系统所分泌，促进疾病发生并有助于效应蛋白的易位，通过Ⅲ型分泌系统（T3S）输送到植物细胞）的基因表达谱是由T3S系统的主要调控因子hrpg和hrpx激活。xynC（是与毒力相关的木聚糖酶，Xps系统的基质）、细胞外蛋白酶和木聚糖酶活动的表达受到hrpg和hrpx的抑制，这表明Xps系统的组件和基质的调节存在差异。

目前，许多植物对于重金属的耐受性都是通过cDNAAFLP技术进行研究的。如CHAO等[28]、CICATELLI等[29]分析锌、铜诱导下植物基因的表达。另外，cDNAAFLP技术对于植物致病菌相关基因的研究也取得了一定进展。ELBEBANY等[30]研究诱导马铃薯根提取物中黄萎病致病的相关基因。

3.4构建转录连锁图LI等[31]构建了太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的遗传连锁图谱，为定位重要的经济性状基因及最终实现太平洋牡蛎的标记辅助选育和遗传改良奠定了基础。目前，许多水产生物的基因连锁图谱都是采用该技术加以构建的。如日本对虾（Marsupenaeu japonicus）[32]、皱纹盘鲍（Haliotisdiscus hannai）[33]和条斑紫菜[34]等。QIN等[35]发明了一种计算机程序GenEST，实现了EST序列与cDNAAFLP基因表达信息的双向连接和转化。

4小结与展望

cDNAAFLP技术在研究植物差异表达基因方面已经得到了广泛的应用，随着近年来该技术的发展，其应用范围已经逐渐扩展至微生物中差异表达基因的研究。微生物具有结构简单、繁殖速度快、变异易识别、研究周期短、进展迅速的特点，因此，微生物是研究生物进化的良好材料。通过cDNAAFLP技术对其基因组的研究分析，将为揭示一系列诸如生命起源、生物发育和进化等生命活动的重大基本问题提供极大的帮助。乳酸菌广泛存在于自然界，与人类关系密切，其中部分乳酸菌为益生菌。当前乳酸菌研究主要集中在发酵、生理特性等方面。近年来大量有益乳酸菌基因组序列的完成，为从分子水平上研究乳酸菌提供了大量的信息，为cDNAAFLP技术在乳酸菌的应用提供了平台。cDNAAFLP技术能够在转录水平全面系统地获取乳酸菌的转录组学信息，有利于在分子水平上获悉乳酸菌的代谢机制，尤其是发酵过程中的整体变化，进而促进乳酸菌的应用。

综上所述，cDNAAFLP技术自诞生之后，在很多研究领域中得到了广泛应用。cDNAAFLP技术已逐渐成为研究基因差异表达行之有效的方法，是研究功能基因组的新方法、新手段，具有广阔的应用前景。随着新技术的出现，以及技术间相互结合使用、优化，该技术必将具有更旺盛的生命力，相信该技术在基因差异表达研究中具有巨大的潜在应用价值。

参考文献

[1] LIANG P，PARDEE A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction [J].Science，1992，257：967-971.

[2] REIJANS M，LASCARIS R，GROENEGER A O，et al.Quantitative comparison of cDNAAFLP，microarrays，and gene chip expression data in Saccharomyces cerevisiae[J].Genomics，2003，82：606-618.

[3] LI H M，CUI Y H，WU L X，et al.cDNAAFLP analysis of differential gene expression related to cell chemotactic and encystment of Azospirillum brasilense[J].Microbiological Research，2010，166：595-605.

[4] BOVE C G，LAZZI C，BERNINI V，et al.cDNAamplified fragment length polymorphism to study the transcriptional responses of Lactobacillus rhamnosus growing in cheeselike medium[J].Journal of Applied Microbiology，2011，111：855-864.

[5] VOS P，HOGERS R，BLEEKER M，et al.A new technique for DNA fingerprinting [J].Nucleic Acids Research，1995，23（21）：4407-4414.

[6] BACHEM C W B，HOEVEN R S V D，BRUIJN S M D，et al.Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP：analysis of gene expression during potato tuber development [J].Plant Journal，1996，9：745-753.

[7] DONSON J，FANG Y W，ESPIRITU-SANTO G，et al.Comprehensive gene expression analysis by transcript profiling [J].Plant Molecular Biology，2002，48：75-97.

[8] KUHN E.From library screening tomicroarray technology：strategies to determine gene expression profiles and to identify differentially regulated genes in plants [J].Annals of Botany，2001，87：139-155.

[9] MONEY T，READER S，QU L J，et al.AFLP-based Mrna fingerprinting [J].Nucleic Acids Research，1996，24：2616-2617.

[10] BACHEM C W B，OOMEN R J F J，VISSER R G F.Transcript imaging with cDNAAFLP：a step-by-step protocol [J].Plant Molecular Biology Report，1998，16：157-173.

[11] HAJIZADEH H，RAZAVIA K，MOSTOFIB Y，et al.Identification and characterization of genes differentially displayed in Rosa hybrida petals during flower senescence [J].Scientia Horticulturae，2011，128：320-324.

[12] LIAO J L，ZHANG H Y，LIU J B，et al.Identification of candidate genes related to rice grain weight under high-temperature stress [J].Plant Science，2012，196（2012）：32-43.

[13] NAZEEM P A，JOSE S，SHEEBA N K，et al.Differential gene expression for bacterial wilt incidence in tomato （Solanum lycopersicum L.） revealed by cDNAAFLP analysis[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，2011，76：197-203.

[14] TANG J，LOU Z Y，WANG Y，et al.Expression of a small heat shock protein （CTLhsyapr）screened by cDNAAFLP approach is correlated with hydroxysafflor yellow A in safflower （Carthamus tinctorius L.）[J].Biochemical Systematics and Ecology，2010，38：722-730.

[15] ZHANG W W，WANG S Z，LIU K，et al Comparative expression analysis in susceptible and resistant Gossypium hirsutum responding to Verticillium dahliae infection by cDNAAFLP [J].Physiological and Molecular Plant Pathology，2012，80：50-57.

[16] FAUVIN A，CHARVET C，ISSOUF M，et al.cDNAAFLP analysis in levamisoleresistant Haemonchus contortus reveals alternative splicing in a nicotinic acetylcholine receptor subunit[J].Molecular & Biochemical Parasitology，2010，170：105-107.

[17] HENRIQUEZ M A，DAAYF F.Identification and Cloning of Differentially Expressed Genes Involved in the Interaction Between Potato and Phytophthora infestans using a Subtractive Hybridization and cDNAAFLP Combinational Approach[J].Journal of Integrative Plant Biology，2010，52 （5）：453-467.

[18] GUO J，JIANG R H Y，KAMPHUIS L G，et al.A cDNAAFLP based strategy to identify transcripts associated with avirulence in Phytophthora infestans[J].Fungal Genetics and Biology，2006，43：111-123.

[19] KORPELAINEN H，KOSTAMO K.An improved and costeffective cDNAAFLP method to investigate transcription-derived products when high throughput sequencing is not available [J].Journal of Biotechnology，2009，145：43-46.

[20] SILVA A C RD，FERRO J A，REINACH F C，et al.Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities [J].Macmillan Magazines Ltd，2002，417：459-463.

[21] LEYMARIE J，BRUNEAUX E，GIBOT-LECLERC S，et al.Identification of transcripts potentially involved in barley seed germination and dormancy using cDNAAFLP [J].Journal of Experimental Botany，2007，58（3）：425-437.

[22] BOTTON A，FERRIGO D，SCOPEL C，et al.A cDNAAFLP approach to study ochratoxin production in Aspergillus carbonarius[J].International Journal of Food Microbiology，2008，127：105-115.

[23] LIN D X，TANG H，WANG E T，et al.An ABC transporter is required for alkaline stress and potassium transport regulation in Sinorhizobium meliloti[J].FEMS Microbiol Letters，2009，293：35-41.

[24] DELLAGI A，BIRCH P R J，HEILBRONN J，et al.cDNAAFLP analysis of differential gene expression in the prokaryotic plant pathogen Erwinia carotovora[J].Microbiology，2000，146：165-171.

[25] CAMPALANS A，PAGES M，MESSEGUER R.Identification of differentially expressed genes by the cDNAAFLP technique during dehydration of almond （Prunus amygdalus）[J].Tree Physiology，2001，21：633-643.

[26] VALVERDE A，OKON Y，BURDMAN S.cDNAAFLP reveals differentially expressed genes related to cell aggregation of Azospirillum brasilense[J].FEMS Microbiol Letters，2006，265：186-194.

[27] SZCZESNY R，JORDAN M，SCHRAMM C，et al.Functional characterization of the Xcs and Xps type II secretion systems from the plant pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv vesicatoria[J].New Phytologist，2010，187：983-1002.

[28] CHAO Y E，ZHANG M，FENG Y，et al.cDNAAFLP analysis of inducible gene expression in zinc hyperaccumulator Sedum alfredii Hance under zinc induction [J].Environmental and Experimental Botany，2010，68：107-112.

[29] CICATELLI A，LINGUA G，TODESCHINI V，et al.Arbuscular mycorrhizal fungi modulate the leaf transcriptome of a Populus alba L.clone grown on a zinc and copper-contaminated soil [J].Environmental and Experimental Botany，2012，75：25-35.

[30] ELBEBANY A F，HENRIQUEZ M A，BADAWI M，et al.Induction of putative pathogenicityrelated genes in Verticillium dahliae in response to elicitation with potato root extracts [J].Environmental and Experimental Botany，2011，72：251-257.

[31] LI L，GUO X J.A primary linkagemap for the Pacifc oyster Crassostrea gigaswith AFLP marker [J].Journal of Shellfish Research，2002，21（1）：433.

[32] LI Y T，KEREN B，EMANUELA M，et al.Genetic mapping of the kuruma prawn Penaeus japonicus using AFLP markers [J].Aquaculture，2003，219：143-156.

[33] WILSON J，LI Y，WHAN V，et al.Genetic mapping of the black tiger shrimp Penaeusmonodon with amplified fragment length polymorphism [J].Aquaculture，2002，204：297-309.

[34] IITSUKA O，NAKAMURA K，OZAKI A，et al.Genetic information of three pure lines of Porphyra yezoensis （Bangiales，Rhodophyta） obtained by AFLP analysis [J].Fish Science，2002，68：1113-1117.

[35] QIN L，PRINS P，JONES J T，et al.GenEST，a powerful bidirectional link between cDNAsequence data and gene expression profiles generated by cDNAAFLP [J].Nucleic Acids Research，2001，29（7）：1616-1622.