HPLC法测定不同产地女贞叶中熊果酸的含量

王丽　闫春生　贾安　信建豪 黄涛

摘要

[目的]用高效液相色谱法（HPLC）考察5个不同产地女贞叶中熊果酸的含量。[方法]用高效液相色谱法所用色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21），检测波长为210 nm。[结果]方法学考察结果，回归方程为Y=4.715 5X+17.918，R2=0.999 4，熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml浓度范围内线性关系良好。用该方法测得5个不同产地女贞叶中熊果酸的含量存在差异，其中上海市产的含量最高，为2.157 4 mg/g，南阳唐河产的含量最低，为0.863 0 mg/g。[结论]同一采集时间，不同产地的女贞叶因环境因素，所含熊果酸的含量差异较大。

关键词女贞叶；熊果酸；HPLC；含量测定

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）28-09738-02

Determination of the Content of Ursolic Acid in Folium Ligustrum lucidus from Different Habitats by HPLC

WANG Li， YAN Chunsheng， JIA An et al（Huanghe Science and Technology College， Zhengzhou， Henan 450006）

Key words[Objective] The content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats was investigated by HPLC. [Method] Chromatographic column is eighteen alkyl silane bonded silica gel column chromatography （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， the mobile phase is acetonitrilemethanol-0.5% ammonium acetate （67∶12∶21）， the detection wavelength is 210 nm. [Result] Methodological study results： the regression equation： Y=4.715 5X+17.918， R2=0.999 4， the content of ursolic acid in 5.21-125.12 μg/ml， the concentration of the linear relationship is good. The content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats existis differences， the highest content of Shanghai produced is up to 2.157 4 mg/g， the lowest content produced in Nanyang Tanghe is 0.863 0 mg/g. [Conclusion] At the same acquisition time， the content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats has significant differences because of environmental factors.

Key wordsLigustrum lucidus； Ursolic acid； HPLC； Content determination

女貞叶为木犀科植物女贞Ligustrum lucidus Ait.的叶[1]，又名冬青叶、土金刚叶、爆竹叶[2]。 民间常用鲜女贞叶咀嚼慢咽的方法治疗口腔溃疡[3-4]。《中药大辞典》载有女贞叶性平、味微苦、无毒，具有祛风、明目、消炎消肿、祛瘀散结、生肌止痛及收敛防腐之功效。在民间应用很广，主要用于滋阴止血[5-6]。但目前，关于女贞叶没有相关的质量标准，为了更好地开发应用，笔者特对其主要有效成分之一熊果酸的测定方法进行考察，并选取5个不同产地的女贞叶，对其熊果酸的含量进行比较，为女贞叶质量标准的制定提供依据。

1材料与方法

1.1材料

样品采自郑州市、上海市、新乡市、南阳唐河县、焦作武陟县5个不同地区，分别编号20130801、20130802、20130803、20130804、20130805。经药学教研室李勉教授鉴定为木犀科植物女贞Ligustrum lucidus Ait.的叶。8月底采摘，清洗干净，阴干，粉碎，过50目筛，备用。以郑州市采集的女贞叶（编号20130801）为主要对象进行研究。

1.2试剂

乙醇、乙酸铵（试剂均产自天津市分船化学试剂科技有限公司）为分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯；熊果酸对照品（批号为110742—200313，供含量测定用）由中国药品生物制品检定所提供。

1.3试验仪器

Agilent 1200 LC 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，生命科学与化学分析仪器部）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超声仪KQ5200M（东莞市科桥超声波设备有限公司）；微孔滤膜（0.45 μm）水膜和有机膜。

1.4试验方法

1.4.1

色谱条件。色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21），检测波长为210 nm，流速为1.0 ml/min，柱温40 ℃，进样量20 μl。

1.4.2

对照品溶液制备和标准曲线绘制。

精密称取熊果酸10 mg，加75%乙醇制成浓度为0.25 mg/ml的对照品溶液，摇匀，即可。精密量取储备液相应量，然后用75%乙醇依次稀释对照品溶液，其浓度分别为 5.21、10.42、20.82、41.64、93.28、125.12 μg/ml，分别进样20 μl，记录测定峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.3

供试品溶液制备。

取样品粉末各1 g，精密称定置10 ml具塞锥形瓶中，加入75%乙醇10 ml，超声提取30 min置于室温中放冷后，加入75%乙醇定容，摇匀，滤过取续滤液，以0.45 μm微孔滤膜滤过后作为供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 对照品与样品的高效液相色谱峰图

从图1可以看出，在相同的色谱条件下，样品在对照品相同的出峰时间（t=12.9 min）也有一个峰出现，说明该峰即为样品中熊果酸的峰，且该条件下样品中熊果酸的峰与相邻峰的分离度较大，说明此条件适合该样品测定熊果酸。

2.2 对照品溶液制备和标准曲线绘制

以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，由图2可见，其回归方程为Y=4.715 5X+17.918（R2=0.999 4），表明熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.3 稳定性试验

取同一供试品溶液分别在0、1、2、4、8 h進样20 μl，测定峰面积并计算RSD值。结果发现，在0、1、2、4、8 h进样测得同一样品中酸果酸的峰面积分别为1 832.40、1 814.60、1 640.00、1 638.20、1 765.98，其RSD为4.8%，表明该样品中熊果酸在8 h内是稳定的。

图1 对照品（a）和样品（b）熊果酸的HPLC图谱

图2 对照品溶液标准曲线

2.4 精密度试验

通过取对照品溶液（熊果酸0.25 mg/ml）重复进样5次，每次进样20 μl，测定对照品的峰面积分别为2 197.43、2 098.64、2 057.08、2 106.09、2 027.22，其RSD值为2.7%，表明所用仪器精密度良好。

2.5 加样回收率试验

精密称定已测知熊果酸含量的女贞叶供试品6份，分别精密加入熊果酸0.7 mg，按照“1.4.3”项方法进行提取和含量测定。结果发现（表1），熊果酸的平均加样回收率为95.01%，RSD为0.2%。符合相关要求。

2.6 样品含量测定

精密称定5个产地的女贞叶样品各3份，按照“1.4.3”项下样品处理，得供试液，20 μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积，用外标法计算供试品中熊果酸的含量。由表2可见，不同产地，女贞叶中熊果酸的含量差异较

大。其中上海市产的女贞叶中熊果酸含量最高，为2.157 4

mg/g；其次是新乡市产的女贞叶，含量为2.027 3 mg/g；郑州市产的女贞叶含量为1.570 7 mg/g；焦作武陟县产的女贞叶含量是1.067 mg/g；南阳唐河县产的女贞叶中熊果酸含量最低，为0.863 0 mg/g。

3 结论

（1）通过对HPLC法的方法学进行考察，结果得到回归方程为Y=4.715 5X+17.918（R2=0.999 4），熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml浓度范围内线性关系良好；且样品稳定，仪器精密度和样品的加样回收率均达到了相关要求，说明该方法灵敏、可靠、准确。

（2）通过对选取的5个不同产地的女贞叶中熊果酸的含量进行分析计算，结果发现女贞叶中熊果酸的含量差异较大。其中，上海市产的女贞叶中熊果酸含量最高，为2.157 4 mg/g，南阳唐河县产的女贞叶中熊果酸含量最低，为0.863 0 mg/g，说明不同产地因温度、水分、土壤等不同，药材中的化学成分的含量存在差异。这也为女贞叶质量标准的制定提供依据。

参考文献

[1]

国家药典委员会.中华人民共和国药典，一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：43.

[2] 胡同瑜.实用中药品种鉴别[M].北京：人民军医出版社，2012：545.

[3] 田凤鸣，张咸远.中国奇方全书[M].北京：科技出版社，2011：1266.

[4] 史书达.中国民间秘验偏方大成[M].3版.苏峰：内蒙古科学技术出版社，2012：1022.

[5] 徐谨，罗玲英，吴铁容.二至丸的临床应用与剂量关系研究[J].亚太传统医药，2011，7（1）：131-136.

[6] 王长春，王永春，刘珊.浅谈女贞子药性特点与配伍运用[J].山东中医药大学学报，2013，37（3）：188-189.