南方水稻黑条矮缩病毒S9基因RNA干涉载体的构建

袁斌 张舒 吕亮

摘要

[目的]构建抗南方水稻黑条矮缩病毒（Southern Rice Black-Streaked Dwarf Virus）的RNA干涉载体。[方法]通过PCR扩增、克隆并测序获得SBRSDV病毒S9基因的703 bp片段，与其他地方分离物S9序列的同源性高达99%，将此片段连接至pDS1301上，并对阳性克隆进行菌落PCR、酶切等验证。 [结果]成功构建了可以用于转化水稻产生转基因植株的抗SBRSDV病毒的RNAi载体。[结论]利用SBRSDV病毒S9基因的部分片段构建了pDS1301S9 RNA双链干涉载体，为创建水稻抗SBRSDV新种质奠定了基础。

关键词 南方水稻黑条矮缩病;RT-PCR;外壳蛋白;RNAi

中图分类号 S511  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2014）34-12048-03

Construction of RNA Silencing Expression Vectors for S9 of Southern Rice Black-Streaked Dwarf Virus

YUAN Bin1，2，3， ZHANG Shu1，2，3， LV Liang1，2，3

（1. Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064; 2. Key Laboratory of Integrated Management of Crops of Central China， Ministry of Agriculture， Wuhan， Hubei 430064; 3. Hubei Key Laboratory of Crop Disease， Insect Pests and Weeds Control， Wuhan， Hubei 430064）

Abstract [Objective] Construction of RNA silencing expression vectors resistant to Southern Rice BlackStreaked Dwarf Virus. [Method] A 703bp fragment of S9 gene of SRBSDV was produced through PCR amplification， cloned and sequenced. The results show that the S9 gene identity is as high as 99%. The fragment was cloned into RNAi vector pDS1301. The positive clones were detected by PCR， enzyme digestion. [Result] The experimental results showed that RNAi vector resistant to SRBSDV was constructed successful. [Conclusion] The vector of pDS1301S9 by using part of the S9 gene fragments was constructed for SBRSDV virus， the result laid a foundation for creating the rice new germplasm of resistance to SBRSDV.

Key words Southern Rice BlackStreaked Dwarf Virus; RTPCR; Coat protein; RNAi

基金項目 湖北省自然科学基金项目（2011CDB118）;十二五”农村领域国家科技计划课题（2012BAD19B03）;湖北省农业科学创新中心项目。

作者简介

袁斌（1970-），男，江西宜春人，副研究员，博士，从事分子植物病理学研究。

收稿日期 20141023

2001年广东阳西县首次发现一种新的水稻病毒病，将其命名为南方水稻黑条矮缩病（SRBSDV）[1]。该病严重危害水稻，还可危害其他禾本科作物;发展速度快;病毒由迁飞性害虫白背飞虱为主要传毒媒介，且传毒效率非常高。SRBSDV迅速上升成为湖北省水稻生产的主要病害之一。

目前，利用抗（耐）病毒病和介体的品种是防治植物病毒最经济、简便而有效的措施，但抗病（虫）的抗源较少。生物工程技术在创建抗病毒材料上起着重要作用。自1986年首次将烟草花叶病毒（Tabacco Mosaic Virus， TMV）的CP基因转入烟草以来[2]，马铃薯X病毒（Potato Virus X， PVX）、黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus， CMV）和马铃薯Y病毒（Potato Virus Y， PVY）等多种病毒的CP蛋白被转移进入相应的植物体中产生新的抗病种质。还有利用病毒复制酶和运动蛋白（Movement Protein，MP）基因介导的抗病性[3-6]。

随着分子生物学技术的进步，以病毒基因组序列为靶位点来进行RNAi，抑制病毒的复制与表达以达到抗病毒病的目的手段出现，抗病效果表现得更为高效。这种由dsRNA介导的序列特异性的转录后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing， PTGS），在植物抗病毒的研究中具有广阔的前景。目前，我国还没有鉴定出抗该病的水稻品种，也未见有RNAi创建出抗病新种质的报道。笔者使用在水稻成熟使用的双元载体pDS1301构建SRBSDV病毒沉默载体，以期通过转基因的方式创建水稻抗SRBSDV新种质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

供试材料。2010年从武汉、鄂州、崇阳等地采集水稻疑似病株进行检测。湖北崇阳发病田块的水稻病株用于克隆SRBSDV病毒的S9基因片段。

1.1.2

试剂与载体。pGEMGZ载体是利用pGEMT改造，在BamH I的外侧添加有Sac I位点，Kpn I的外侧添加有Spe I位点，以方便扩增产物的克隆和双链RNAi载体的构建。Taq DNA合成酶、dNTP和限制性内切酶均购自TaKaRa公司;质粒抽提和胶回收试剂盒也购自TaKaRa公司;PCR引物由Invitrogen公司合成。用于构建RNA干涉的载体pDS1301来自华中农业大学作物遗传国家重点实验室[7]。

1.2 方法

1.2.1

湖北省水稻SRBSDV疑似病株的检测。根据文献提供的检测SRBSDV和RBSDV的特异引物序列合成引物[8-9]，采用RTPCR技术检测，SRBSDV的特异引物对为S10F和S10R，RBSDV的特异引物对为RS10F和RS10R（表1）。利用湖北省各地水稻疑似病株抽提总RNA，用随机引物将总RNA反转录为cDNA作为模板，分别以S10F和S10R、RS10F和RS10R为引物对进行扩增检测样品的病原物。PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2  μl，2.5 mmol的混合dNTP 2 μl，25 mmol的MgCl2 2 μl，Taq DNA 聚合酶0.2 μl，10 μmol/L上游引物0.5 μl， 10  μmol/lL下游引物0.5  μl，模板0.5  μl，加ddH2O 至20  μl。PCR反应参数：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 35个循环;72 ℃延伸10 min。

1.2.2

SRBSDV病毒S9片段的获取。利用S9iF和S9iR引物对扩增S9基因的片段（表1）。采用RTPCR技术扩增得到SRBSDV病毒CP和S9基因的各个片段。将扩增得到的产物挖胶回收，克隆到pGEMGZ载体上，送公司测序验证。将获得的S9基因片段阳性克隆命名为S9pGEM。

1.2.3

SRBSDV病毒S9基因的生物信息学分析。将获得的S9基因序列在NCBI上作Blast分析，并比较其与其他地区S9基因之间的同源性。用ClustalW进行DNA和氨基酸的多序列比对，确认差异位点，并进行进化分析。

表1 用于检测SRBSDV及构建载体的引物序列

引物名称引物序列（5'～3'）酶切位点

S10FCGA TCT TAT CCA TAA TGG TG

S10R GCC ATA GTG TGT CAC GTC TG

RS10FAAGGAAACATTACTTTGAAGCC

RS10RTGGTCAATTCATATTCATCTGG

S9iFCGGGGTACCGAACGCAAGAGAATGGCAGACC Kpn I

S9iRCGCGGATCCCAATAGAAACCAATAATGGACGABamH I

1.2.4

SRBSDV S9双元抑制载体的构建。将S9pGEM和载体pDS1301质粒均使用BamH I和Kpn I双酶切，回收外源片段和酶切后的pDS1301载体。然后将它们等摩尔比混合连接，得到的阳性克隆命名为S9ds1。再将S9pGEM和S9ds1质粒均用Spe I和Sac I双酶切，分别回收外源片段和S9ds1载体，等摩尔比混合连接。获得阳性克隆即S9双元抑制载体，命名为pDS301S9。双酶切体系为：2种限制性内切酶（BamH I和Kpn I）各2 μl，10×buffer 2.5  μl，质粒为20  μl，用ddH2O补足至50  μl，37 ℃酶切3 h。用Spe I和Sac I双酶切时，10×buffer 5  μl，其余相同。连接体系：利用微量核酸浓度测定仪，测定回收产物的浓度，分别计算载体和外源片段的摩尔数。10×连接buffer 1  μl，连接酶1  μl，根据计算结果决定外源和载体的体积，其余补足ddH2O至10  μl。电转DH10B感受态后，涂带有卡那霉素抗性的LB皿，筛选阳性克隆。

2  结果与分析

2.1 湖北省SRBSDV发病植株的鉴定

自从南方各个稻作区暴发SRBSDV以来，湖北省作为主要水稻产区也发现有疑似SRBSDV的发生，但长期以来认为是另一种病毒病RBSDV。2010年在崇阳采集疑似病株进行鉴定（图1），结果

显示湖北省崇阳病毒病疑似植株应是SRBSDV，不是RBSDV。应用相同的方法检测鄂州和武汉水稻田疑似病株，结果相同，表明湖北省发生的与RBSDV症状高度相似的矮缩病为SRBSDV。将扩增产物测序结果与SRBSDV的CP同源性高达99%（结果未显示）也证实了这一点。

注：1、2、3为不同的病株，CK1为阳性对照，CK2为阴性对照。

圖1 湖北省崇阳水稻矮缩植株RTPCR鉴定

2.2 S9基因片段的获取

以SRBSDV水稻病株cDNA作为模板，以S9iF和S9iR为引物，扩增获取了703 bp的基因片段S9（图2A）。PCR扩增获取的片段与预期大小相同。将扩增基因片段连接到pGEMGZ载体上（图2B），并命名为S9pGEM，结果表明，所克隆片段为SRBSDV S9基因的部分序列[10]，进一步证实了前面的结果。

注：A.S9iF和S9iR PCR产物;B.S9pGEMGZ克隆BamH I、Kpn I双酶切鉴定。

图2 湖北省SRBSDV病毒S9基因片段的克隆

2.3 RNA干涉载体pDS1301S9的构建

用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切S9pGEM和pDS1301质粒，获取了S9基因带有BamH I和Kpn I酶切位点接头的外源片

注：A.S9第1链连接到pDS1301，BamH I和Kpn I双酶切檢测;B.S9第2链连接到pDS1301上，BamH I和Kpn I双酶切检测，5、7、9是阳性克隆;C.S9双链抑制载体示意。

图3 pDS1301S9载体构建酶切检测结果

段和载体，回收连接后S9基因片段定向插入pDS1301载体上，获得阳性克隆，命名为S9ds1（图3A）。此载体上带有S9基因的第一链，还需要连接一个反向的第二链。用限制性内切酶Spe I和Sac I双酶切S9pGEM和S9ds1，回收连接后S9基因片段反向插入S9ds1上，即完成了pDS1301S9的构建（图3B），构建的载体结构见图3C。

3 讨论

将水稻黄斑驳病毒（Rice yellow mottle virus， RYMV）复制所需酶的基因部分序列构建RNAi载体转化水稻，诱发基因沉默，使水稻具有RYMV抗性，且抗性能稳定遗传[11]。利用大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus， BYDV）的复制酶基因片断为靶位点构建RNAi载体，并将其导入大麦，在25个转化系中，有9个转化系表现出较强的抗性，且稳定遗传的2个株系后代中， 用酶联免疫吸附法检测不到接种病毒的存在[12]。水稻对SRBSDV缺乏抗性品种，利用RNAi技术创建抗病新种质是一种有效的手段。该研究选择SRBSDV的S9基因作为靶标创建新种质，这是因为S9是SRBSDV病毒一个重要的基因，且与RBSDV病毒中的S9基因具有76%以上的同源性。RNA干涉的机制表明同源基因同源性达到70%以上时，双链RNA产生的小RNA可以干涉同源基因的表达。所以利用SRBSDV病毒S9基因构建的RNAi载体创制的转基因水稻植株可能具备SRBSDV和RBSDV抗性，为进一步研究用一种病毒的基因序列进行RNA干涉从而创制抗2种病毒的水稻新种质提供研究基础。

安徽农业科学                         2014年

参考文献

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