山东半岛地区双相情感障碍20号染色体基因扫描研究☆

栾萌 石姗姗 陈星 周鹏 常学润 王元训 陈刚

山东半岛地区双相情感障碍20号染色体基因扫描研究☆

栾萌*石姗姗△陈星*周鹏*常学润※王元训※陈刚*

目的 通过基因组扫描研究，在山东半岛地区人群20号染色体上发现与双相情感障碍关联的易感基因位点。方法采集104例双相情感障碍患者与1000名正常对照者的外周血液标本，分别建立患者组与对照组的两个DNA混合池样本；采用覆盖整个20号染色体并且间隔大约10 cM的13个微卫星标记，应用Gene Mapper 4.0分别对两个样本进行基因组扫描分析；使用CLUMP软件对两组等位基因频率进行比较。结果患者组与对照组在20号染色体上20p12.2（D20S186）区域的等位基因相对数目有统计学差异（P=0.022）。结论山东半岛地区人群位于20号染色体上的20p12.2与双相情感障碍易感性存在关联，下一步将对该区域进行精细定位，并探索可能存在的易感基因。

双相情感障碍 染色体 基因组 关联

双相情感障碍（bipolar disorder，BD）是一种复杂的多基因遗传性疾病[1-3]。目前已经在欧美人群发现许多与BD关联的染色体区域及可能的易感基因，然而由于存在遗传异质性，不同的国家、地域、种族人群的研究结果往往不尽相同。20号染色体与BD关联区域主要集中在20q12、20q13.31、20p11.2-q11.2等区域[4-6]，但目前尚未见中国人群中有关20号染色体的研究报道。为探寻中国人群中与BD相关联的染色体区域及易感基因位点，本研究选取山东半岛地区BD患者及正常对照者，在20号染色体应用13个间隔大约10 cM遗传距离的微卫星位点进行基因扫描。

1 对象与方法

1.1 研究对象患者组为2005年至2009年山东省精神卫生中心住院的双相情感障碍I型患者。入选标准：符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）双相情感障碍Ⅰ型诊断标准，汉族，发病年龄≤20岁。排除患严重躯体疾病者。在入选的104例患者中，男74例，女30例，年龄14～65岁，平均（26.13±10.94）岁。

对照组来自健康献血者（山东省血液中心提供）。入选标准：汉族，无精神疾病史或精神疾病家族史。排除患严重躯体疾病者。共收集1000名对照，其中男669名，女331名，年龄17～55岁，平均（25.08±5.67）岁。两组之间年龄（t=1.983，P= 0.106）、性别（χ2=0.775，P=0.379）差异均无统计学意义。

全部受试者对本研究知情同意并签署知情同意书，且本研究得到山东省医学科学院基础医学研究所伦理委员会的审核通过。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及混合池的构建 所有研究对象抽取外周静脉血5mL，EDTA抗凝处理，置于-80℃冰箱保存备用。采用常规酚—氯仿法提取患者组与对照组外周血基因组DNA。应用DU 530紫外分光光度计检测患者组和对照组的DNA浓度，将全部研究对象的DNA样本稀释至20 ng/μL。取患者组所有患者基因组DNA样本各10μL进行混合，然后充分混匀，建立患者组DNA混合池；同样的方法建立对照组DNA混合池。以患者组和对照组DNA混合池作为PCR反应的模板。

1.2.2 遗传位点引物的选取和PCR扩增 根据Linkage Mapping Set 2.5套装试剂盒，在20号染色体上选择13个微卫星位点的引物，分别为D20S117、D20S889、D20S115、D20S186、D20S112、D20S195、D20S107、D20S119、D20S178、D20S196、D20S100、D20S171、D20S173，覆盖整个20号染色体，遗传间距约为10 cM，以3种不同颜色的荧光加以标记区分。使用美国应用生物系统公司（ABI）9700 DNA扩增仪进行PCR扩增。总反应体系15μL：浓度为20 ng/μL的基因组DNA混合池模板3μL，引物1μL，Trans PCR SuperMix 9μL，Tag Gold聚合酶（美国Roche）0.1μL，去离子水2μL。PCR反应程序：95℃预变性11min；94℃变性30s；55～59℃退火1min；72℃延伸1min（总共30个循环）；60℃延伸60min。最后放置4℃冰箱保存。

1.2.3 PCR产物的毛细管电泳及基因分型 PCR扩增完成后，在Avant-3130毛细管电泳仪上使用96孔板对两组PCR产物进行电泳分析。在相邻两个孔道中分别加入患者组和对照组的PCR扩增产物4μL，再加入甲酰胺9μL和Liz-500橙色荧光分子量内标0.2μL，充分混匀。将96孔板放入ABI 9700 DNA扩增仪中95℃变性5min后，马上置于冰盒上3 min，之后上样电泳。电泳结束后应用GeneMapper 4.0软件对两组电泳图谱分别进行基因分型。

1.3 统计学方法经基因分型分析，可获得一系列等位基因构成的图谱（allele image pattern，AIP），每个微卫星位点的AIP图谱中峰型的数量反映DNA混合池样本中等位基因数量，峰高则反映相对应等位基因的频率。对各位点等位基因峰图进行分析时，首先计算每个等位基因占该位点所有等位基因的比值，即每个等位基因峰值与该位点所有等位基因峰值总和之比，该比值也代表相应等位基因在DNA混合池样本中的频率。然后计算每个等位基因的相对数目,人类细胞为二倍体，104例患者样本在每个遗传位点上即有208个等位基因（同理,对照组为2000个等位基因），将上述各组比值乘以相应等位基因总数即得到每个等位基因相对数目。采用CLUMP软件，应用χ2检验分析等位基因相对数目差异，检验水准α为0.05。

2 结果

经过3次重复实验，最终得到20号染色体上D20S117、D20S889、D20S115、D20S186、D20S112、D20S195、D20S107、D20S119、D20S178、D20S196、D20S100、D20S171、D20S173等13个微卫星位点等位基因图谱，分型结果见表1。经统计分析，在D20S186（20p12.2）微卫星位点共得到12个等位基因片段，其长度分别为113 bp、115 bp、119 bp、121 bp、123 bp、125 bp、127 bp、129 bp、131 bp、133 bp、135 bp与137 bp，见图1。患者组与对照组在该位点的等位基因相对数目差异有统计学意义（χ2= 22.112，P=0.022）。其他12个位点等位基因相对数目在组间无统计学差异（均P＞0.05）。

3 讨论

国际上近年来已经开展许多关于BD的全基因组扫描研究，发现多个与BD相关联的染色体区域，主要包括2q22-q24、6q23-q24、10q21、12p13.3、16p12、18p、21q22.13、22q12.1、Xq28等[7-11]。然而，国内还未见类似的研究和报道。本研究应用DNA混合池技术对BD患者进行全基因组扫描，该技术是由Barcellos等[12]设计，后来作为标准化方法在欧洲十多个国家对多发性硬化的全基因组基因进行扫描，进一步证实这种方法的有效性[13,14]。本课题组在既往研究中成功采用该方法对精神分裂症等多基因遗传病进行全基因组扫描及关联分析，发现多个与精神分裂症相互关联的阳性位点，并且在关联区域周围选择多个候选基因进行筛选与验证[15-19]。

碳酸锂广泛用于BD的治疗，其主要通过抑制肌醇-1-磷酸酶而引起肌醇-1-磷酸的蓄积，使神经细胞的内消旋肌醇耗竭，最终导致磷酸肌醇（phosphoinositide，PI）通路失敏而发挥作用。在BD患者的血小板中，凝血酶所诱导的与PI通路有关的钙代谢动员活动显著加强。此外，对大脑组织和外周血细胞等研究的结果均提示细胞内信号转导系统异常可能与BD的病理生理过程密切相关[20]。Le等[21]和Ram等[22]检测PI通路的重要侯选基因Gs蛋白α亚单位的基因，该基因定位于20q13区，但未发现该基因存在突变。

之后陆续有研究报道20号染色体与BD的关系。Willour等[4]对56个BD家系中354名成员采用107个微卫星遗传标记进行研究，多点非参数连锁分析结果证实3个区域的优势对数（logarithm of odds，LOD）值大于1，并且最终发现20q12是连锁区域。然而，Hamshere等[5]对383例患病同胞进行连锁分析，未能重复这一结果，却发现另一个连锁区域——20q13.31。但本研究中，没有发现位于上述连锁区域的微卫星标记D20S107、D20S171、D20S173与BD存在关联，这可能是不同地区和种族人群的遗传背景差异造成的。

表1 双相情感障碍20号染色体13个微卫星遗传位点扫描结果

图1 DNA混合池在D20S186位点的扫描图谱横坐标表示等位基因片段长度，纵坐标表示荧光强度。斜线上方数字表示电泳激发的荧光信号强度，下方数字表示等位基因片段长度。A图为双相情感障碍患者组等位基因图谱，B图为对照组等位基因图谱

本研究与瑞士Radhakrishna等[6]的研究结果非常接近。该研究分析一个来自土耳其的常染色体显性的BD大家系，在这个家系中共有13例患者，发病年龄从15岁至40岁不等；对230个遗传标记进行全基因组扫描，随后进行全基因组连锁分析；结果发现阳性区域为20p11.2-q11.2，并且在D20S604、D20S470、D20S836、D20S838等4个位点得到LOD值4.34；单倍型分析将阳性区域定位在D20S186和D20S109两个位点之间（大约42 cM的遗传间距）[6]。这与本研究发现的D20S186位点相吻合。随后，Detera-Wadleigh等[23]和Oedegaard等[24]在BD家系研究中也得到类似的结果。

总之，本研究通过基因组扫描发现，位于20号染色体的微卫星遗传标记D20S186的20p12.2区域与BD相关，在20p12.2区域周围可能存在致病因子，这在国内尚属首次报道。由于本研究的对象仅限于山东地区，且样本量有限，因此要做出肯定的结论，尚需进一步加大样本量以及在不同的地区和人群中开展更为深入和细致的研究。我们下一步将选择高密度遗传标记在D20S186位点附近进行精细定位；同时开展转录组、蛋白组、甲基化以及动物模型的研究，采用交叉策略筛查双相情感障碍的病因。

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Localization of genetic susceptibility loci for bipolar disorder on chromosome 20 in Shandong peninsular.

LUAN Meng,SHI Shanshan,CHEN Xing,ZHOU Peng,CHANG Xuerun,WANG Yuanxun,CHEN Gang.
Laboratory of Medical Geneitcs,Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,18877 Jingshi road,Jinan 250062, China.Tel:0531-82919720.

ObjectiveTo identify the genetic lociassociated with bipolar disorder in Chinese population by the genome scan on chromosome 20 in bipolar disorder patients and healthy people from Shandong peninsula.MethodGenotyping was conducted on DNA pool samples of 104 bipolar disorder patients and 1000 controls using thirteenmicrosatellitemarkers on chromosome 20 spaced at intervals of approximately 10 cM and GeneMapper 4.0 s of tware.CLUMP s of tware was used to analyzemultiallelic markers.ResultSignificant difference of allele frequencies was found atmarkerD20S186(20p12.2)between patients and controls(P=0.022).ConclusionThe data suggest that theD20S186locus (20p12.2)is significantly associated with susceptibility to bipolar disorder in a Chinese Han population in Shandong peninsula.Future studies should focus on the finemapping of this region and assessment of candidate genes.

Bipolar disorder Chromosome Genome Association

R749.4

A

2014-09-09）

（责任编辑：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.12.007

☆国家自然科学基金（编号：30770780）；山东省自然科学基金青年基金项目（编号：ZR2014HQ030，ZR2014HQ042）；山东省医药卫生科技发展计划项目（编号：2013WS0364）

*山东省医学科学院基础医学研究所医学遗传学实验室（济南 250062）

△山东大学齐鲁医院老年病科

※山东省精神卫生中心