双黄连注射剂中黄芩苷抗原合成及抗血清制备分析探讨

2014-04-27叶厚春

亚太传统医药 2014年21期

关键词：双黄连偶联注射剂

叶厚春

(赣县人民医院, 江西赣州 341100)

双黄连注射剂中黄芩苷抗原合成及抗血清制备分析探讨

叶厚春

(赣县人民医院, 江西赣州 341100)

目的：对双黄连注射剂中黄芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制备情况进行分析探讨，为今后药物研究工作提供可靠的参考依据。方法：将黄芪苷与牛血清白蛋白采用高碘酸钠法进行交联，鉴定方法为紫外扫描和SDS-PAGE法；经黄芩苷与牛血清白蛋白复合物对新西兰兔进行免疫产生抗血清，采取ELISA法进行检测。结果：经紫外扫描和SDS-PAGE法证实黄芩苷与牛血清白蛋白发生了交联，ELISA法在新西兰兔体内检测出黄芩苷与牛血清白蛋白复合物的抗血清，抗血清效价为1∶8 000。结论：经高碘酸钠法黄芩苷抗原合成成功，其为黄芩苷单克隆抗体的制备以及ELISA法快速检测黄芩苷提供了可靠的依据，值得关注。

双黄连注射剂；黄芩苷抗原；药物合成；抗血清；鉴定

目前在临床上中药注射剂具有不可替代的作用，在疾病的治疗中发挥重要的价值，减轻了患者的痛苦。然而注射剂不良反应的存在也对其发展产生了一定的阻碍作用[1]。本次实验对双黄连注射剂中黄芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制备情况进行分析探讨，分别采取高碘酸钠法合成、紫外扫描和SDS-PAGE法进行鉴定，并采取ELISA法对抗血清进行检测，具体情况报道如下。

1 实验材料

1.1 仪器

AR1140/C型电子天平，TU-1900型双光束紫外可见分光光度计，DE-1型磁力搅拌器，透析袋，高速冷冻离心机，CM-230超纯水系统，VE-180型电泳槽，EPS300型电泳仪，TY-80A型脱色摇床，THA-3560C高压灭菌锅，核酸蛋白分析仪，微量移液器，BIO-TEKELX-800酶标仪，DZF-6050型恒温干燥箱，MA110型电子天平，超声波清洗器，可调电炉，无菌注射器，酶标板，封口膜。

1.2 实验动物与试剂

本次实验中实验动物为健康新西兰大白兔；试剂包括：黄芩苷单体，蒸馏水，牛血清蛋白，DMF(分析纯)，高碘酸钠，乙二醇(分析纯)，吡啶，二乙基氨基乙基纤维素，生理盐水，β-巯基乙醇， Tris丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵(AP)(分析纯)，十二烷基磺酸钠(SDS)(分析纯)，甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)，戊二醛50%(分析纯)，甘油(分析纯)，硝酸银(分析纯)，柠檬酸(分析纯)，甲醛溶液、冰醋酸(分析纯)，氨水，甲醇、无水乙醇(分析纯)。

2 方法

2.1 抗原合成

精取黄芩苷单体22.3mg，经吡啶溶解，精称高碘酸钠10.7mg，加1mL蒸馏水溶解，将其加入到黄芩苷溶液中，室温下搅拌20min,加入1mL分析纯乙二醇，室温搅拌5min，称取牛血清白蛋白16.25mg，加2mL磷酸缓冲溶液，将牛血清白蛋白溶液加入到上述黄芩苷反应液中，4℃条件下静置过夜，加新配制的NaHB41mL,室温条件下反应3h，然后在反应液中加入磷酸缓冲溶液透析，每6h换一次液，连续透析2天，透析结束后离心分离，取滤液经冷冻干燥最终获得黄色固体粉末[2]。

2.2 抗血清制备

取三只健康雄性新西兰大白兔，两只采取上述制备的黄芩苷抗原进行免疫，另外1只注射生理盐水进行对照。黄芩苷抗原注射流程为：取黄芩苷抗原溶液2mL，加入等体积的弗氏完全佐剂进行乳化后基础免疫，在兔背部进行多点注射，每只兔子注射剂量为2mL，20天后间断性加强免疫，剂量与基础剂量相同，在4次免疫结束后采集兔子耳缘静脉血，4℃条件下保存[3]。

2.3 抗血清分离

精取上述所得血清20mL,加20mL生理盐水进行溶解，再逐滴加入10mL(NH4)SO4饱和溶液,边加边搅拌，混匀后静置30min，在3 000r/min条件下离心20min,取沉淀，加20mL生理盐水，再次加入10mL(NH4)SO4饱和溶液，混匀后静置30min，在3 000r/min条件下离心20min,弃上清，去除白蛋白，上述步骤重复2～3次。用10mL生理盐水将沉淀溶解，装入透析袋中，透析除盐，过夜，4℃条件下透析24h，采取氯化钡对透析液中硫酸根离子进行检查，在确保无硫酸根离子和NH4存在时进行离心操作，将沉淀去除，所得上清液即为抗血清。

3 结果

本次实验中采取紫外扫描仪和SDS-PAGE法对黄芩苷与载体蛋白的偶联成功与否进行了检查，于190～400nm下对其吸收值进行测定，以反应前后紫外吸收光谱改变情况对偶联与否进行判断，如图1所示，经分析，黄芩苷分别于215nm、247nm、279nm及 315nm处均有吸收峰，牛血清蛋白于278nm处出现最大吸收峰，而黄芩苷牛血清蛋白偶联物于271nm出现最大吸收峰，相较于载体蛋白牛血清，偶联无最大吸收峰出现偏移，证实偶联成功；而后采取间接ELISA法对抗血清进行了鉴定，结果发现在新西兰兔体内检测出黄芩苷与牛血清白蛋白复合物的抗血清，将抗血清吸光度为阴性血清吸光度2倍时，抗血清最大稀释倍数为抗血清效价，通过对反应液于波长为450nm处吸光度进行分析，发现抗体效价是1∶8 000，具体见表1。