超声灭活饮用水中隐孢子虫研究

胡健龙,冉治霖,李绍峰,张朝升(.广州大学土木工程学院,广东 广州 50006；2.深圳信息职业技术学院交通与环境学院,广东 深圳 5872；3.深圳职业技术学院,深圳市工业节水及城市污水资源化技术重点实验室,广东 深圳 58055)

超声灭活饮用水中隐孢子虫研究

胡健龙1,3,冉治霖2,3,李绍峰3*,张朝升1(1.广州大学土木工程学院,广东 广州 510006；2.深圳信息职业技术学院交通与环境学院,广东 深圳 518172；3.深圳职业技术学院,深圳市工业节水及城市污水资源化技术重点实验室,广东 深圳 518055)

为研究超声对饮用水中隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)的灭活情况,考察了超声频率、功率、pH值和温度对灭活率的影响,通过形态学观察初步探讨了超声灭活隐孢子虫的机制,并进行了灭活动力学分析.结果表明,低频有利于隐孢子虫灭活,19.8kHz, pH7.2,温度(20±1)℃条件下超声15min灭活率可达92.5%,频率升高灭活率反而下降.在本实验条件下,超声功率103W对隐孢子虫的灭活效果与151W的相近,pH值对超声灭活隐孢子虫的影响不大,36℃超声灭活15min灭活率为95.6%,而在9℃下超声15min灭活率为88.3%,水温升高有利于灭活.灭活前后的形态学变化表明超声空化作用导致细胞膜破坏,细胞质流出从而起到灭活孢囊的效果.超声灭活隐孢子虫遵循假一级反应动力学,灭活隐孢子虫以低频率高功率的效果最好,可认为隐孢子虫的灭活以超声空化的强度为主.

隐孢子虫；超声；饮用水；灭活

以隐孢子虫为代表的致病性微生物感染性极强,可通过食物和水进入人畜体内,引起痉挛、反胃及腹泻等不良症状,是儿童、老人和免疫缺陷者的重要的致病原[1].在未用抗逆转录病毒治疗的艾滋病患者中感染率可高达100%[2].

隐孢子虫体外有一层卵囊包裹对传统的加氯消毒法有极强的免疫性[3].而且研究显示,消毒后水体中的余氯会生成很多致癌副产物[4],因此不能通过单纯的增加氯消毒剂的投量对其进行灭活.近些年研究证实超声波具有引起细胞溶解以及其他一些损伤细胞的能力,比如细胞膜破坏,DNA降解,细胞器损耗等[5].超声的空化作用被认为是导致微生物灭活的主要原因,超声的空化作用会产生瞬时的高温高压,并由此产生一系列的物理化学反应[6].超声技术在微生物灭活领域展示出的高效性以及不产生消毒副产物的优势,被认为是一项新型有效的消毒技术[5].目前国内研究超声灭活致病性微生物主要是针对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等[7-8],缺乏对隐孢子虫灭活的研究.而国外超声灭活隐孢子虫的研究采用声场条件单一,仅采用固有的频率与功率,对外部环境的影响也未作深入探讨[5,9-10].

本研究不仅通过调节超声的频率、功率,且改变pH值、温度等条件,探究声场和外部环境等因素对超声灭活隐孢子虫的影响;通过形态学观察进行灭活机制探讨;开展超声灭活隐孢子虫动力学研究,以期为超声或超声与其他方法耦合用于水中病原微生物的灭活进行知识积累.

1 材料与方法

1.1 实验装置与实验方法

实验所用超声装置为中国科学院上海声学研究所提供(图1),主要分为超声发生装置与超声传感器两部分.该套设备超声反应器有4部,对应4个超声传感器,其中20kHz、40kHz、60kHz对应一部超声反应器与一个传感器、200kHz、400kHz、800kHz各自对应一部超声反应器与一个传感器,功率均为(0～150)±2W可调.

图1 超声处理装置示意Fig.1 Experiment apparatus of ultrosonic icradiation1.超声反应器;2.进水口;3.超声传感器;4.反应容器; 5.水浴槽;6.出水口

将50mL虫样浓度3×105个/mL置入反应容器中,控制温度(20±1) ,pH℃ (7±0.2),调节频率功率,超声处理15min,期间每隔1min用1.5mL离心管取样1mL进行活性检测.

1.2 实验材料

隐孢子虫(Cryptosporidium)为鸡源隐孢子虫卵囊C. baileyi,HauC 株,浓度为 3.0×106个/mL. 4℃保存于 2.5%重铬酸钾悬浮溶液中.4,6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI),购于 Sigma(USA).普匹碘胺(PI), 购于Sigma (USA). Hanks 平衡盐溶液,购于Sigma (USA).

1.3 分析方法

采用荧光染色法[11-13],所取样品 4℃、10000r/ min离心5min,用HBSS平衡溶液漂洗3次;弃上清液于160μL,加20μL DAPI、20μL PI使用液,37℃避光温浴1h.取出样品再用HBSS平衡溶液漂洗3次,将未染上色的DAPI与PI洗掉.处理后样品涂片,在荧光显微镜下镜检,所用荧光显微镜为OLYMPUS BX-51 (Japan).

图2 隐孢子虫荧光染色照片Fig.2 Picture of oocyst observed by4',6-diamidino-2-phenylindole and Propidium Iodide

DAPI会在450nm紫外激发光下发出天蓝色荧光,而PI会在630nm绿色激发光下发出亮红色荧光.DAPI能够透过细胞膜与DNA结合,而 PI无法正常通过细胞膜,只有死亡的细胞才会被 PI染色,因此可联合应用DAPI和PI判断隐孢子虫的活性[14].图2为DAPI及PI荧光显色照片.

灭活率计算公式为:

PI+表示PI显色,DAPI+表示DAPI显色.

2 结果与讨论

2.1 超声频率对灭活的影响

图3 频率对隐孢子虫灭活率的影响Fig.3 Influence of ultrasonic frequency on inactivation of Cryptosporidium parvum

为考察超声频率对灭活隐孢子虫的影响,实验在 pH=7.0±0.2,P=151W,温度(20±1)℃的条件下改变超声频率进行.由图3可以看出,随时间的延长,不同频率下的灭活率均先迅速增加最后趋于平稳,且低频超声的灭活效果要优于高频超声.19.8kHz条件下超声 15min灭活率可以达到92.5%,在39.6kHz条件下超声15min的灭活率为90.6%.而在806.3kHz的条件下,15min灭活率仅为 71.3%.这可能是由于在功率一定的情况下,频率增加会导致空化作用更难发生[15],而空化作用的强度是超声灭活隐孢子虫的主要影响因素.有研究显示频率增高会导致声波膨胀相时间变短,空化泡来不及形成、与此同时声波的压缩相时间也同时变短,空化泡无法及时崩溃,从而导致空化作用变弱[16].Ashokkumar等[9]采用20kHz固定频率超声处理隐孢子虫15min灭活率达到90%以上.Oyane等[10]采用超声频率 26.6kHz隐孢子虫卵囊的浓度为 2260个/mL,当流速在 33mL/min时灭活率为 97%.因此低频超声下隐孢子虫灭活率更高,说明低频更利于灭活隐孢子虫.

2.2 超声功率对灭活的影响

图 4表明超声频率 19.8kHz,pH=7.0±0.2,温度(20±1)℃的条件下,不同功率对超声灭活隐孢子虫的影响.从图中可看出,随功率的增加隐孢子虫的灭活率也在逐渐提高.在 151W 的条件下超声 15min的灭活率为 92.5%,103W 的灭活率为90.2%,说明功率达到103W,对灭活率提高有限.

图4 超声功率对隐孢子虫灭活率的影响Fig.4 Influence of ultrasonic power on inactivation of Cryptosporidium parvum

而在 21W 的条件下 15min的灭活率仅为60.20%.其原因可能是在频率一定的情况下,功率增加会导致空化泡运动加剧.同时,空化泡振动周期变长,空化泡半径减小,空化泡由产生到破灭所需的时间也因此变长[15].因此空化作用增强,隐孢子虫灭活率上升,说明超声功率增加,有利于隐孢子虫的灭活.

2.3 pH值对灭活的影响

调节超声频率 19.8kHz,功率 151W,温度(20±1)℃,分别在pH值为5.3、6.4、7.2、8.9和9.7的条件下进行反应.由图5可以看出,不同pH值条件下,超声灭活隐孢子虫效果有所区别.pH值在7.2条件下超声15min灭活率最高为92.5%.而在pH值为6.4和8.9的条件下灭活率分别为88.2%和 90.3%,略低于中性条件下的灭活率,但总体来说pH的影响不大.

图5 饮用水pH值对隐孢子虫灭活率的影响Fig.5 Influence of pH on inactivation of Cryptosporidium parvum

2.4 温度对灭活的影响

超声频率19.8kHz,功率151W,pH为7.2,分别在温度 9,14,21,27,31,36℃的条件下进行超声灭活实验.由图6可以看出,随温度的升高灭活率逐渐增加,36℃超声灭活15min灭活率为95.6%,而在9℃的条件下超声15min灭活率为88.3%.最终灭活率相差不大,但是从图中可以看出温度对灭活速率还是有影响的,温度越高灭活速率也相应越高.在36℃下灭活率达到80%以上所需要的时间不到2min,而9℃条件灭活率达到80%以上需要反应 10min.有研究显示温度升高会导致产生空化泡的阀域值降低,也就是说会使空化作用更容易发生[16].

图6 温度对隐孢子虫灭活率的影响Fig.6 Influence of temprature on inactivation of Cryptosporidium parvum

2.5 灭活效果形态学观察

从图7(a)和图7(b)中可以看出在超声之前隐孢子虫具有完整的细胞壁,将细胞核牢牢的包裹于其中,而图 7(c)中可以清楚的看到在超声处理15min后细胞壁结构遭到破坏,细胞质流出,有些甚至连细胞核也一起流出只有一层空的细胞壁.超声的空化作用会产生瞬时的高温高压,并伴随着大量具有氧化性的自由基产生,能够使微生物的细胞壁、细胞膜被破坏,导致细胞质流出,使细胞转运系统及酶系统受到破坏[17]. Oyane等[18]等的研究显示超声可以破坏酵母菌的细胞膜结构,与本实验得出超声破坏隐孢子虫的细胞结构的结果相似.

图7 显微镜下隐孢子形态照片Fig.7 Pictures of Cryptosporidium parvum under micro-scope(a)超声前×400显微镜下隐孢子虫的形态照片;(b)超声前×400显微镜下隐孢子虫DIC照片;(c)超声(19.8kHz,151W,pH 7.2,20±1 ℃)15min 后×400显微镜下隐孢子虫的形态照片

2.6 动力学分析

超声灭活隐孢子虫的效果主要取决于超声空化的强度,而能够影响超声空化强度的主要声场参数为超声的频率与功率.所以本实验采用尝试法,对频率与功率影响灭活的数据做初步的动力学分析.

图8 不同超声频率下动力学曲线Fig.8 Evolution of ultrasonic frequency versus sonication time

图9 不同功率下动力学曲线Fig.9 Evolution of ultrasonic power versussonication time

图8和图9分别是不同频率与功率下的超声灭活隐孢子虫的动力学曲线,从表1和表2可知,超声灭活隐孢子虫的反应遵从假一级反应动力学,相关线性度都大于0.97.在功率一定的情况下动力学常数随着频率的增加降低,而当频率一定时动力学常数随着功率的增加而增高. 超声功率为151W时反应速率为21W的2.99倍,而频率为 19.8kHz时反应速率为频率为 806.3kHz的2.42倍,表明在本研究的实验条件下,功率与频率对超声灭活隐孢子虫的动力学常数影响相近.

表1 不同超声频率下假一级反应动力学常数及其相关线性度Table 1 Pseudo-first order rate constant(kobs) and R2observed for different ultrasonic frequencies

表2 不同超声功率下假一级反应动力学常数及其相关线性度Table 2 Pseudo-first order rate constant(kobs) and R2observed for different ultrasonic power

3 结论

3.1 频率和功率对超声灭活隐孢子虫有显著影响. 低频率有利于超声对隐孢子虫的灭活,当反应温度(20±1)℃,功率151W,pH为7.2时,超声频率19.8kHz反应15min灭活率达到92.5%.低频率有利于超声对隐孢子虫的灭活;超声功率增加隐孢子虫灭活率也随着增加.

3.2 pH值对超声灭活隐孢子虫的影响不大;温度对超声灭活隐孢子虫的灭活率影响不大,但对灭活速率有显著的影响,温度越高灭活速率越快. 3.3 超声的空化作用产生瞬时的高温高压,破坏细胞的形态导致细胞膜变形,细胞质流出从而起到杀灭细胞的效果.

3.4 超声灭活隐孢子虫以低频率高功率的效果最好,而这两个因素对应的超声空化作用也最强,且超声灭活隐孢子虫遵循假一级反应动力学,相关线性度都大于 0.97,因此可认为超声对两虫的灭活以超声空化的强度为主.

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Inactivation of Cryptosporidium parvum in drinking water by ultrasonic irradiation.

HU Jian-long1,3, RAN Zhi-lin2,3,

LI Shao-feng3*, ZHANG Chao-sheng1(1.School of Civil Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China；2.Department of Transportation and Environment, Shenzhen Institute of Information Technology, Shenzhen 518172 China；3.Shenzhen Key Laboratory of Industrial Water Saving and Municipal Sewage Reclamation Technology, Shenzhen Polytechnic Institute, Shenzhen 518055, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：431～436

Ultrasonic on inactivation of Cryptosporidium parvum was studied under different operational parameters, such as ultrasonic frequency, ultrasonic power, pH and temperature. The mechanism of inactivation of Cryptosporidium parvum was preliminary discussed by morphological observation, and inactivating kinetic analysis was also focused. The results indicated that low frequency favored the inactivation of Cryptosporidium parvum, 92.5% of inactivating rate could be achieved under the condition of 19.8kHz ultrasonic (15min), pH 7.2and temperature 20±1℃, while the inactivating rate decreased if the frequency increased. Furthermore, the inactivating rates were almost the same regardless of ultrasonic power was 103W or 151W, and the value of pH had slight effect on inactivating. The inactivating rate was 95.6% using ultrasonic treatment for 15min at 36℃ while 88.3% at 9℃, which indicated higher temperature was conducive to the inactivation of Cryptosporidium parvum. Ultrasonic cavitation caused cell membrane damage and cytoplasm outflow in inactivating Cryptosporidium parvum. Ultrasonic inactivation of Cryptosporidium parvum was in line with pseudo-first-order kinetics, and lower frequency and higher power lead to better ultrasonic cavitation. Therefore, it was suggested that the intensity of ultrasonic cavitation was the main factor for inactivating Cryptosporidium parvum.

Cryptosporidium；ultrasonic；drinking water；inactivation

X703.1

：A

：1000-6923(2014)02-0431-06

胡健龙(1988-),男,湖北荆州人,广州大学土木工程学院市政工程硕士研究生,主要从事隐孢子虫与贾第虫灭活研究.

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