益胃祛瘀消痰方对慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织细胞凋亡及相关基因表达的影响*

河北省任丘市卫生学校 刘连臣 张睦清 杜志超（任丘 062550）

益胃祛瘀消痰方为经多年临床筛选出的治疗慢性萎缩性胃炎 （CAG）的经验方，具有益气养阴，祛瘀消痰之功，临床用于治疗CAG具有较好的疗效。本研究采用流式细胞术 （FCM）观察了益胃祛瘀消痰方对CAG大鼠胃组织细胞凋亡与增殖及其相关调控基因Caspase3、Bcl－2和Fas基因蛋白表达的影响，以研究益胃祛瘀消痰方在治疗CAG方面的作用机理。

1 材料

1.1 实验动物 Wistar大鼠，60只，雄性，体质量180～200 g，购自河北省实验动物中心 （合格证号:冀动字1001005）。

1.2 药物和试剂 益胃祛瘀消痰方药物组成:黄芪、丹参、麦冬、炒白芍、炒白术、炙甘草、清半夏、黄连、丁香、陈皮等，采用水煎和醇提相结合方法，将提取液分别浓缩为含生药0.367 g/mL、0.183 g/mL浓度的水溶液。三九胃泰胶囊和维霉素片均用蒸馏水制成0.1 g/mL浓度的混悬液。脱氧胆酸钠购自北京奥博星生物技术有限公司。Fas、Bcl－2和Caspase3一抗单克隆抗体、二抗工作液（羊抗鼠PITC－IgG荧光抗体）均由美国Santa Cruz公司提供。

1.3 主要仪器 Epics－XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司生产。

2 方法

2.1 动物分组与造模 将实验大鼠常规喂养1周后，随机分为正常组、模型组、维霉素组、三九胃泰组、益胃祛瘀消痰方低剂量组、益胃祛瘀消痰方高剂量组，共计6组。动物造模参照相关文献采用的方法［1］即:先灌饲0.2%的脱氧胆酸钠溶液，用量为每只1.5 mL/d，5 h以后，再灌饲50℃的热水，用量为每只2 mL/d，同时加用饥饱失常的喂养方法，（2 d足量喂食，1 d停食），正常组大鼠普通饲料喂养，每天灌饲等量的蒸馏水，造模时间共8周。

2.2 给药方法 造模成功后，开始灌胃治疗，其中，益胃祛瘀消痰方低剂量组和高剂量组分别按照1.83 g/kg、3.67 g/kg的剂量灌胃，维霉素组和三九胃泰组均按照1g/kg的剂量灌胃，正常组和模型组均给予等剂量的蒸馏水灌胃;1次/d，用药体积均按照1 mL/100 g计算。

2.3 胃组织样本制作 治疗5周后，麻醉实验大鼠，股动脉取血后，迅速剖开腹部，分离胃组织，沿胃窦近幽门口至胃大弯方向取适量的胃组织，于生理盐水中冲洗后，以70%乙醇溶液固定，置于冰箱中冷藏待检。

2.3.1 制备单细胞悬液:将固定的胃组织放置于100目的不锈钢网上，网下置一平皿，用剪刀剪碎至1 mm3大小，再用眼科镊子轻搓组织块，边搓边以PBS液冲洗，直至将组织搓完。然后将平皿中的混悬液，用300目筛网过滤以去除细胞团块，收集细胞悬液，500～800 r/min离心2 min，弃去上清，保留沉淀，加入PBS 0.3 mL，稀释混匀后，将单细胞悬液分成4份，调整每份的细胞数为1×106，分别用于检测细胞凋亡、Caspase3、Bcl－2和Fas蛋白表达。

2.3.2 细胞凋亡DNA含量染色:取1×106细胞悬液0.1 mL，加入10%鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶 （PI）1 mL，在4℃冰箱染色30 min，以500目铜网过滤，上机检测。

2.3.3 Bcl－2、Caspase3、Fas蛋白免疫荧光标记:将鼠抗人单克隆抗体工作液0.1 mL，加入到单细胞悬液1×106/mL中，室温孵育30 min，加入PBS 10 mL洗涤1次，弃去上清液，加入羊抗鼠PITC－IgG二抗工作液100μL，室温孵育30 min，加入PBS 10 mL离心，弃去上清，除去未结合的荧光二抗，再加入PBS 0.1 mL并用500目的铜网过滤后，即可上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底作为对照和阴性对照。

2.3.4 检测方法:采用Epics－XLⅡ型流式细胞仪，检测前以 flow－checkTMFluorpheres（10μm）荧光微球作为标准样品调整仪器CV值在2%以内。

2.4 测量资料分析方法 应用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期拟合分析，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，以细胞凋亡指数 （AI）表示细胞凋亡程度，细胞增值指数 （PI）代表细胞的增值活性，免疫荧光指数 （FI）表示蛋白表达水平。

3 结果

3.1 益胃祛瘀消痰方对CAG大鼠胃组织细胞凋亡的影响 模型组与正常组比较，胃组织细胞AI值、G0/G1期细胞百分率均明显升高 （P＜0.01）;PI值和 G2/M期以及 S期细胞百分率降低 （P＜0.05）。经药物治疗后，与模型组相比，各治疗组G0/G1期细胞百分率和AI值均明显下降 （P＜0.01）;G2/M期以及S期细胞百分率和PI值均明显增高 （P＜0.01或P＜0.05）;其中，高、低剂量组AI值均低于维霉素组和三九胃泰组 （P＜0.05或P ＜0.01）。结果详见表1。

表1 各组大鼠胃组织细胞凋亡及不同时期增殖时相比率的结果比较（±s），n=10

表1 各组大鼠胃组织细胞凋亡及不同时期增殖时相比率的结果比较（±s），n=10

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与维酶素组和三九胃泰组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 AI G0/G1（%） G2/M（%） S（%）PI正常组 10.31±1.51＊＊ 75.68±6.24＊＊ 9.51±0.66* 14.42±1.55* 23.96±2.46＊＊模型组 24.46±3.12 80.89±8.85 7.73±0.88 11.28±0.92 18.96±1.83高剂量组 14.55±2.78＊＊△△ 73.21±7.71＊＊ 11.55±1.75＊＊ 15.16±1.16* 26.59±2.37＊＊低 剂 量组 15.84±3.03＊＊△ 74.48±8.92＊＊ 11.41±1.92＊＊ 15.38±0.52＊＊ 26.81±3.02＊＊维霉素组 17.83±2.89＊＊ 75.83±6.84＊＊ 10.82±1.52＊＊ 14.18±1.73* 24.92±2.63＊＊三九胃泰组 17.41±3.88＊＊ 75.49±5.65＊＊ 11.16±1.28＊＊ 13.69±0.88* 24.89±1.13＊＊

3.2 益胃祛瘀消痰方对CAG大鼠胃组织细胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表达的影响 模型组与正常组比较，大鼠Caspase3和Fas蛋白表达FI值均升高，而 Bcl－2蛋白表达 FI值降低 （P＜0.01或P＜0.05）。经用药治疗后，各治疗组Fas、Caspase3蛋白表达FI值均低于模型组，Bcl－2蛋白表达FI值均高于模型组 （P＜0.05或P＜0.01）;其中，高、低剂量组的Caspase3蛋白表达FI值均低于维霉素组和三九胃泰组 （P＜0.05或P＜0.05）;高剂量组Fas蛋白表达FI值低于低剂量组、维霉素组和三九胃泰组 （P＜0.05或P＜0.01）。结果详见表2。

表2 各组大鼠胃组织细胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表达变化（±s），n=10

表2 各组大鼠胃组织细胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表达变化（±s），n=10

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与维酶素组和三九胃泰组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别Caspase3 FI Fas FI Bcl－2 FI正常组 1.03±0.01＊＊ 0.83±0.13＊＊ 1.00±0.15＊＊模型组 1.32±0.03 1.28±0.21 0.74±0.21高剂量组 1.06±0.02＊＊△ 0.89±0.12＊＊△△ 0.98±0.19＊＊低剂量组 1.07±0.03＊＊△ 1.08±0.23* 0.95±0.11＊＊维霉素组 1.18±0.03＊＊ 1.12±0.21* 0.92±0.08＊＊三九胃泰组 1.16±0.02＊＊ 1.06±0.18* 0.97±0.11＊＊

4 讨论

中医学中无CAG的病名，根据其临床表现可归属于中医的“胃痞”“胃脘痛”“嘈杂”等疾病范畴，其病因多是由于饮食不节、或情志不遂、或操劳过度，损伤脾胃等，渐致脾胃损伤，气机失调，胃络瘀阻，湿阻痰生。气阴不足，痰瘀互阻为本病的主要病机，益气养阴，祛瘀消痰为其有效治疗方法。故益胃祛瘀消痰方中选用黄芪、白术、茯苓益气健脾，麦冬、炒白芍、炙甘草酸甘化阴，柔肝和胃，丹参、赤芍、莪术活血祛瘀，清半夏、白芥子燥湿消痰，陈皮、黄连、丁香通降胃气。诸药合用，脾气得补，胃阴得充，气机得畅，血脉畅通，湿祛痰生，故治疗CAG可获满意的疗效。

胃组织细胞的过度凋亡，可严重影响胃的生理功能。Bcl－2与Fas是与细胞凋亡关系较为密切的基因，两者的作用各不相同。Bcl－2基因主要作用是通过抗细胞凋亡，以延长细胞寿命，促进细胞生存 。［2］Fas基因为细胞膜表面受体蛋白，它是与T淋巴细胞膜上Fas－L结合，向细胞内传递“死亡信号”，诱导靶细胞发生凋亡［3］，Caspase3是Caspase家族成员之一，是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，Caspase3介导的凋亡在人体多种类型细胞中普遍存在着，其降解凋亡标志性底物的活性最强。Caspase3可被该家族其它成员如Caspase9和6激活。Bcl－2，Bcl－xL等抗凋亡蛋白可通过与Fas等促凋亡蛋白形成异二聚体阻止线粒体释放细胞色素 C（cyt－c），或直接与 a－paf－1、Caspase9结合成三元复合物从而阻止Caspase9途径的激活，Caspase3不能被活化，因而细胞凋亡受抑制。［4］本项研究结果表明，模型组大鼠的胃组织中细胞凋亡率最高，同时 Bcl－2表达量最低，Caspase3和Fas表达量最高;说明Caspase3和Fas表达上调、Bcl－2表达下调，是造成细胞凋亡增加的原因之一。经药物治疗后，与模型组相比，各治疗组Bcl－2表达量明显增加，Caspase3和Fas表达量明显降低，细胞凋亡率明显下降，说明益胃祛瘀消痰方能够加速胃组织细胞的DNA合成及分裂增殖，抑制胃组织细胞过度凋亡，以保证胃组织细胞的正常功能，从而达到抗CAG的作用，此可作为益胃祛瘀消痰方治疗CAG的作用机制之一。

［1］ 李红平，毛万姬，邹学正.丹白麦门冬汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜病理形态学的影响 ［J］.陕西中医，2007，28（2）:243－245

［2］ LalierL，Cartron PF，Juin P，et a1.Bax activation and mitochon－ drial insertion during apoptosis ［J］ .Apoptosis，2007，12（5）:887－896

［3］ Lockshin RA.Programmed celldeath:history and future ofa con －cept［J］ .JSoc Biol，2005，199（3）:169 －73

［4］ 于利利，王泽华.Bcl－xL和Caspase3在人卵巢癌细胞株凋亡过程中的调节作用 ［J］.华中科技大学学报 （医学版），2003，32（2）:205－207

（2014－03－07 收稿）