有氧运动对中老年大鼠骨髓内皮祖细胞增殖能力的影响

龚晓明,郑 澜,瞿树林,雷志军,凡 婷,陈伊琳

(1.四川理工学院体育学院,四川 自贡 643000;2.湖南师范大学体育学院,湖南 长沙 410012)

有氧运动对中老年大鼠骨髓内皮祖细胞增殖能力的影响

龚晓明1,2,郑 澜2,瞿树林2,雷志军2,凡 婷2,陈伊琳2

(1.四川理工学院体育学院,四川 自贡 643000;2.湖南师范大学体育学院,湖南 长沙 410012)

目的:探讨有氧运动对中老年大鼠骨髓来源内皮祖细胞增殖能力的影响。方法:健康中年雄性SD大鼠12只,按体重随机分为两组,即空白对照组和有氧运动组。采用乳酸阈测定法和递增负荷跑台训练建立有氧运动模型,每周训练6天,为期16周。方案结束后12h提取大鼠骨髓,运用密度梯度离心法分离得到单个核细胞,以EGM-2培养诱导其分化获取内皮祖细胞,通过双荧光染色法观察细胞对乙酰化低密度脂蛋白的摄取和与荆豆凝集素1的结合,并结合形态学特征鉴定内皮祖细胞。倒置显微镜下计数贴壁细胞数量和计算集落形成率以反映细胞增殖情况。结果:各组贴壁细胞数量第7d多于第48h(P＜0.01);与对照组相比,有氧运动组贴壁细胞数量明显增加(P＜0.01),且集落形成率大(P＜0.01)。结论:有氧运动能促进中老年大鼠骨髓来源的内皮祖细胞增殖。

有氧运动;内皮祖细胞;骨髓;细胞培养;增殖

众所周知,心血管疾病是老年人群中的常见病,研究表明,增龄能导致内皮细胞功能损害,从而使外周动脉和小阻力动脉的内皮依赖性血管舒张受损,弹性降低,进而引发高血压、冠心病等心血管疾病[1-2]。研究证实,体育锻炼尤其是有氧运动能改善老年人的血液循环和心、脑血管功能[3-5],但机制不明确。

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一种能自我更新、增殖分化为内皮细胞(ECs)的干细胞,在某些生理、病理状态下,EPCs可通过骨髓释放入血,黏附于血管内皮,不断增殖、分化形成单层内皮结构,参与微血管再生和内皮修复[6],而血管结构和功能损害的早期标志便是内皮功能障碍[7]。有实验表明,体育锻炼可以增加冠心病患者和有心血管病危险因素者的EPCs数量[8],还可增加内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量、增强内皮功能,从而避免血管疾病发生[9]。

前期实验发现有氧运动能使青年大鼠心肌血管壁上的AC133(又称CD133)蛋白表达增多[10-11](AC133是早期EPCs的特异性表面标记物),后又通过实验证实经有氧运动的大鼠心肌组织微血管壁上有EPCs存在[12],且大量增殖[13]。本研究通过体外培养有氧运动后老年大鼠骨髓来源的内皮祖细胞,探讨有氧运动是否能影响其增殖能力,从而改善血管内皮修复和血管再生能力,为体育锻炼对老年人心脑血管影响的机制提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康雄性14月龄Sprague-Dawley大鼠12只,体重为460.5±59.26g(由湖南农业大学提供)。用国家标准啮齿类动物饲料饲养,生活期间室温保持20℃-23℃,相对湿度45-55%,每天光照12h。适应性喂养1周后,按体重随机各分为两组,即空白对照组和有氧运动组。

1.2 仪器与试剂

相差倒置显微镜(Olympus,日本),荧光显微镜(Nikon,日本),动物实验跑台(杭州立泰科技有限公司),大鼠淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物工程研究所),EGM-2完全培养基(Clonetics,Lonza, USA),Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL,Invitrogen,USA),FITC标记的荆豆凝集素1 (FITC-UEA-1,简称lectin,Sigma,USA)。

1.3 运动训练安排

运用雷志军报道的乳酸阈测定法监控有氧运动强度[14],确定递增负荷式训练的有氧运动方案(表1),每天跑台训练1次,每周6天,共16周。

表1 大鼠训练方案(速度×持续时间)

1.4 EPCs分离、培养及诱导分化

训练方案结束后12h,称量体重并记录后,用0.4%水合氯醛lmL/100g体重麻醉,70%的酒精中浸泡1min(除头部),将大鼠呈仰卧位固定于木板上,置超净工作台内,暴露其胸腔,用注射器自心尖快速抽血至无血液抽出,剪开两后肢皮毛,取下股骨和胫骨,用5mL注射器吸PBS液反复冲洗其骨髓腔收集骨髓冲洗液。将骨髓腔冲洗液加入含有大鼠淋巴细胞分离液的离心管(按比例1:1),22℃下2000rpm离心20min,用吸管收集中间白膜层的单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),0.01mol/L PBS液洗涤2次,依次以2000rpm及1500rpm室温离心10min。用EGM-2完全培养基调整细胞密度至3×106/cm2接种于培养瓶,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养48h后更换培养液,去除未贴壁细胞,之后每3d换液一次,应用相差倒置显微镜连续观察体外培养EPCs的形态及增殖情况。

1.5 EPCs的双荧光染色鉴定

采用前期报道的方法进行EPCs的双荧光染色鉴定[15]。

1.6 EPCs增殖能力检测

贴壁细胞计数:细胞培养48h后换液,每个样本随机取5个视野,倒置显微镜下计数贴壁细胞数目(20 ×10),绘制柱状图;细胞培养至第7d,按上述方法倒置显微镜下计数贴壁细胞数目(20×10),绘制柱状图。

集落形成率(集落数目):培养至第10d,每个样本各取3盘计数细胞集落数,每集落至少含50个细胞,求平均值(n=6)。

1.7 统计分析

实验数据用SPSS17.0统计学软件分析。两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较进行单因素方差分析,显著性差异水平α=0.05,P＜0.05,差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 双荧光染色鉴定结果

贴壁细胞被Dil-ac-LDL染色后发红色荧光,与FITC-UEA-1结合发绿色荧光,而发黄色荧光的细胞为双荧光染色阳性,可鉴定为正在分化的EPCs(图1)。

图1 EPCs的荧光染色鉴定(×100)

2.2 形态学观察结果

骨髓分离后获得的MNCs培养48h后半量换液,见大部分细胞已贴壁,其中少量呈梭形,表明细胞开始进入贴壁生长阶段。第5-7d,贴壁细胞集落开始形成,即集落生成单位(colony-forming unit,CFU),数量较少、大小不一,表明此时细胞的增殖开始活跃[16]。第10d细胞集落明显增多,彼此相连并聚集于培养瓶中间区域生长(图2)。第12d观察细胞集落与第10d在集落细胞形态及贴壁梭形细胞密度上大致相似,表明此阶段细胞增殖缓慢,进入平台期。倒置显微镜下,两组细胞在各阶段的形态没有明显差异。

图2 各组细胞培养至48h、第7d和第10d的形态(×100)

2.3 EPCs增殖能力检测结果

培养48h和第7d,有氧运动组贴壁细胞数量较对照组都增加(P＜0.01),各组细胞在7d内都有增殖(P＜0.01)(图3)。培养至第10d,有氧运动组贴壁细胞集落形成率为8.33±1.42,比对照组的5.69±0.91高(P＜0.01)。

图3 48h和第7d细胞贴壁数目

3 分析与讨论

动物实验证明,骨髓来源的EPCs能够迁移到血管形成活跃的组织,参与病理和生理性血管形成[17],而人体实验也证实,骨髓来源的EPCs在缺血组织中起到了促进新血管生成作用[18]。研究也显示,年龄增长会导致骨髓EPCs数量减少,增殖、迁移和粘附能力下降,从而降低修复内皮的功能,而通过骨髓EPCs移植可帮助损伤的内皮修复[19-20]。本研究通过对中年大鼠进行16周的有氧运动训练,中年大鼠已进入老年期[21],但骨髓的EPCs仍能在体外培养7d内持续增殖,而有氧运动不仅促进这种增殖,而且能使细胞形成更多的集落,表明这种运动很可能促进衰老机体的血管内皮修复,有待对细胞黏附能力等情况进行检测后确认这一结果。这一结论跟前期发现的外周血EPCs增殖情况类似[15],如果外周血中增殖的EPCs仅仅是早期EPCs,那么骨髓中的EPCs增殖又有何意义?骨髓中的EPCs主要是晚期EPCs,这种EPCs只少量存在于外周血中,易在人脐静脉内形成单层ECs[5],因此,它的主要功能应当是修复内皮,虽不直接参与血管再生,但具有促进和协助作用。此外,某些干细胞在一定条件下可诱导分化为其他干细胞[22],但目前尚无证据证明早期和晚期EPCs能相互转化,所以前期研究中发现的外周血EPCs是否部分或全部来源于骨髓,仍需进一步研究证实。

另外,老年人的ECs损伤速率较年轻人快,这样持续性的细胞损伤或机能异常会导致EPCs永久性的缺失或衰竭,而我们的EPCs可能是有限的[23]。因此运动导致的EPCs增多究竟是“一过性”还是“永久性”的,仍需进一步探索。

4 结论

(1)中老年大鼠经有氧运动后,其骨髓来源的MNCs在体外诱导培养条件下的EPCs可被Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1良好标记与鉴定。

(2)16周规律有氧运动能促进中老年大鼠骨髓来源的EPCs增殖。

衷心感谢中南大学湘雅医学院中心实验室祝和成教授与吴尚辉老师、湖南师范大学生命科学院吴秀山教授以及湖南师范大学医学院杨华中和任翔老师在作者实验过程中给予的指导和支持!

[1]陶军,靳亚非,王礼春,等.年龄对血管弹性和内皮细胞功能的影响[J].中华心血管病杂志,2003,31(4):250-253.

[2]孙艺玮,姜维良.内皮祖细胞与肢体缺血疾病的研究现状[J].基础医学与临床,2014,34(2):266-269.

[3]周庆,曹春玲,李红俊,等.不同运动方式对老年糖尿病下肢血管病变血流的影响[J].中国实用护理杂,2004,20(3B):4-5.

[4]任爱华,王雁,朱利月.运动锻炼对高血压患者血压和血管弹性的影响[J].心血管医学杂志,2005,14(3):201-202.

[5]熊政纲,谢定,吴承德,等.健身锻炼对延缓老年男子心血管衰老的影响[J].中国现代医学杂志,2001,11(2):52-54.

[6]Kawamoto A,Gwon HC,Iwaguro H,etal.Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells formyocardial ischemia[J].Circulation,2001,103(5):634-637.

[7]崔斌,黄岚,武晓静,等.内皮祖细胞移植对血管内膜修复的影响[J].中国病理生理杂志,2007,23(4):625-628.

[8]Yoshiki Matsuo,Toshio Imanishi,Yasushi Hayashi,et al.The Effect of Endothelial Progenitor Cells on the Development of Collateral Formation in Patients with Coronary Artery Disease[J].Internalmedicine,2007,5:127-134.

[9]Yun-hong Ding,Chen Yang,Xiao-dong Luan,etal.Exercise preconditioning ameliorates inflammatory injury in ischemic rats during reperfusion[J].Acta Neuropathol,2005,109:237-246

[10]Karen Gertz,Josef Priller,Golo Kronenberg,et al.Physical Activity Improves Long-Term Stroke Outcome via Endothelial Nitric Oxide Synthase-Dependent Augmentation of Neovascularization and Cerebral Blood Flow[J].Circ.Res.,2006,99:1132-1140.

[11]郑澜,杨小波,刘铭,等.低氧训练对大鼠心肌组织血管内皮祖细胞标记AC133表达的影响[J].中国运动医学杂志, 2009,28(2):139-141.

[12]龚晓明.有氧运动对EPCs诱导大鼠心肌微血管新生能力的影响[D].湖南长沙:湖南师范大学,2010.

[13]龚晓明,郑澜,瞿树林,等.模拟高住低练对大鼠外周血EPCs增殖能力的影响[J].中国运动医学杂志,2010,29(2): 141-144.

[14]雷志军.规律有氧运动对老龄大鼠心肌抗氧化酶的影响及基因调控机理的探讨[D].湖南长沙:湖南师范大学,2010.

[15]龚晓明,郑澜,瞿树林.有氧运动对中老年大鼠外周血内皮祖细胞增殖及黏附能力的影响[J].现代预防医学,2014,41 (3):527-530,537.

[16]Noel M.Caplice,Bendan Doyle.Vascular Progenitor Cells: Origin and Mechanisms of Mobilization,Differentiation,Integration,and Vasculogenesis[J].Stem Cells and Development, 2005,14:122-139.

[17]Asahara T,Masuda H,Takahashi T,etal.Bonemarrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovas-cularization[J]. Circ Res,1999,85:221-228.

[18]Crosby JR,KaminskiWE,Schatteman G,et al.Endothelial cells of hematopoietic originmake a significant contribution to adult blood vessel formation[J].Circ Res,2000,87:728-730.

[19]陈剑飞.年龄对骨髓内皮祖细胞修复损伤血管内膜影响的实验研究[D].重庆:第三军医大学,2006.

[20]陈剑飞.移植不同年龄大鼠骨髓EPCs对损伤内膜增殖的影响[J].中国病理生理杂志,2007,23(11):2274-2275.

[21]施新猷.医用实验动物学[M].北京:人民军医出版社, 1999:388.

[22]王玮,方志成,刘志祥,等.骨髓间充质干细胞体外定向诱导内皮祖细胞的实验研究[J].心血管康复医学杂志,2006,15 (3):232-234,245.

[23]Christian Jung,Nicole Fischer,Michael Fritzenwanger,etal. Endothelial progenitor cells in adolescents:impact of overweight, age,smoking,sport and cytokines in younger age[J].Clin Res Cardiol,2009,98:179-188.

Effects of Aerobics on Proliferative Capacity in Endothelial Progenitor Cells from Bone M arrow of O ld M ale Rats

GONGXiao-Ming,et all
(Sichuan University of Science&Engineering,Zigong Sichuan,643000)

Objective:The paper is to explore the effects of aerobics on proliferative capacity in endothelial progenitor cells from bonemarrow of old male rats.Method:12 old male Sprague-Dawley rats are randomly and averagely divided into 2 groups,the control group and the aerobics group.The aerobic exercise mode is established by using the methods of lactic acid threshold and incremental treadmill exercise.Mononuclear cells from bonemarrow are obtained by density gradient centrifugation 12 hours after the scheme has ended up.The cells are suspended in conditioned medium EGM-2 for culturing in vitro.Their phenotypes are confirmed by uptake of acetylated LDL and binding of fluorescein isothiocyanate(FITC)-labeled Ulex europaeus agglutinin 1(UEA-1)lectin.Inverted microscope observation is adopted to understand the morphological changes of endothelial progenitor cells and to calculate cells count and colony forming efficiency,so that the proliferation situation of endothelial progenitor cells is obtained.Results:Adherent cells increasemore obviously than group control both at48h and day 7(P＜0.01).The number of adherent cells and colony forming efficiency in aerobics group ismore than that in the control groups(P＜0.01).Conclusion:Proliferative capacity of endothelial progenitor cells from bonemarrow in old male rats can be developed by aerobic exercise.

aerobic exercise:endothelial progenitor cells:bonemarrow;cell culture;proliferation

G804.2

:A

:1001-9154(2014)10-0060-04

G804.2

:A

:1001-9154(2014)10-0060-04

国家自然科学基金项目(项目号:30671011);中国博士后科学基金(项目号:20080430155);教育部留学回国人员科研启动基金(2009年)

龚晓明(1981-),女,四川乐山人,硕士,讲师,主要从事运动的心血管适应机理研究。

2014-03-30