长期大负荷运动对大鼠空间学习记忆及海马神经粘附分子的影响

袁琼嘉,李垂坤,李 雪,高丕明

(1.成都体育学院运动医学系,四川 成都 610041;2.成都学院体育学院,四川 成都 610106; 3.四川省骨科医院,四川 成都 610041)

长期大负荷运动对大鼠空间学习记忆及海马神经粘附分子的影响

袁琼嘉1,李垂坤2,李 雪1,高丕明3

(1.成都体育学院运动医学系,四川 成都 610041;2.成都学院体育学院,四川 成都 610106; 3.四川省骨科医院,四川 成都 610041)

目的:研究7周大负荷游泳运动对大鼠空间学习记忆及海马神经粘附分子(NCAM)的影响。方法:雄性SD大鼠40只,随机分为空白对照组(C组)、空白+水迷宫组(CM组)、大负荷运动组(HL组)和大负荷运动+水迷宫组(HLM组)4组,每组10只。C组和CM组常规饲养,不加干预；HL组和HLM组进行7周大负荷游泳运动。7周后,C组和HL组断头取海马组织,采用Realtime PCR和Western blot检测NCAM mRNA和蛋白表达；7周后,应用Morris水迷宫检测CM组和HLM组大鼠定位航行和空间探索次数。结果:(1)实验期间,HL组大鼠体重第5-7周末均非常显著低于C组(P＜0.01)；HLM组大鼠体重第4-7周末均非常显著低于CM组(P＜0.01)。(2)Morris水迷宫平均逃避潜伏期,两组在前3天的空间探索逃避潜伏期与后5天的学习记忆均有非常显著性差异(P＜0.01),CM组第2～10天平均逃避潜伏期均显著性短于第1天(P＜0.01),第3-10天平均逃避潜伏期均显著性短于第2天(P＜0.05)；HLM组第2～10天平均逃避潜伏期均显著性低于第1天(P＜0.01),第4-10天平均逃避潜伏期均显著性短于第2天(P＜0.05)。Morris水迷宫空间探索实验,HLM组平均穿越次数多于CM组(P＞0.05)。(3)HL组NCAM基因和蛋白表达均高于C组(P＜0.05)。结论:7周大负荷运动后虽然大鼠逃避潜伏期缩短了,空间探索穿越次数有所增加,但随负荷增加,大鼠表现就越不稳定,可能影响或阻碍大鼠学习记忆的形成；长期大负荷运动提高了大鼠海马NCAM基因和蛋白表达,提示其机制可能是参与了损伤后神经的修复。

运动；学习；记忆；海马；NCAM

随着现代竞技体育的飞速发展,体育竞争日趋激烈,为了战胜对手,取得优异运动成绩,最大限度地挖掘人体的运动潜能,导致运动负荷接近甚至超出人体生理负荷的极限,进而对机体产生一系列负面影响。近年来,大运动负荷引起中枢神经系统的紊乱现象倍受关注,研究表明神经细胞黏附分子(Neural Cell Adhesion Molecule,NCAM)与神经细胞轴突生长及延伸、神经通路跨膜信号的转导、神经纤维髓鞘及纤维束的形成、神经细胞的识别及转移、突触形成及重塑、学习记忆的形成与巩固等方面有着密切的关系[1-5]。

中枢神经系统是对不良刺激的最敏感部位,往往容易出现某些高级功能(如学习、记忆能力等)的紊乱。因此,本实验对大鼠进行大负荷游泳运动,采用Morris水迷宫进行行为学测试,以大鼠学习记忆能力的变化为突破口。通过对大鼠学习记忆能力的测试以及了解海马NCAM基因、蛋白的表达情况,探讨大负荷运动后对大鼠空间学习记忆能力及其对相关基因的影响,为研究大负荷运动与海马学习记忆的神经机制提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组及训练方案

SPF级健康雄性SD大鼠40只购于成都达硕生物科技有限公司[动物生产许可证:CSXK(川)2008-24],体重为160～200g,8周龄。动物房环境温度26 ±2℃,相对湿度50%～65%,大鼠分笼饲养,自由饮水进食,自然昼夜照明。适应性喂养1周后随机为A、B两组,20只/组。A组7周后再随机分为2组(10只/组):空白对照组(Control,C组)和水迷宫组(Control and Morris,CM组)。B组7周游泳运动后再随机分为2组(10只/组):大负荷运动组(Heavy Load,HL组)和大负荷运动+水迷宫组(Heavy Load and Morris, HLM组)。C组和CM组大鼠常规饲养；HL组和HLM组大鼠进行大负荷游泳运动。大鼠游泳运动方案参照袁琼嘉[6]等人的实验造模模型。待游泳结束后,断头取脑,并剥离海马组织,装入冷冻管,迅速放入液氮中保存备用。

1.2 Morris水迷宫实验

CM组和HLM组7周游泳运动结束后,进行Morris水迷宫(MorrisWater Maze)实验。本实验Morris水迷宫的水池内壁为黑色,直径为150 cm、高60 cm的圆形水池,水温控制在32±2℃,水中并加入墨水。在水池圆心作两条相互垂直的直线将池壁分为4个象限,再将一个直径为12 cm、高为45 cm的圆形黑色站台放在靶象限(设为第一象限)内,站台没入水下2 cm。水池上方安置摄像机,用于同步记录大鼠运动轨迹。实验方案分2阶段:第1阶段进行定位航行实验(Place Navigation),所有大鼠均训练10天,1次/d。将大鼠面向池壁从每个象限边缘中点入水,在水池上方有一摄像头与电脑相连,可以通过电脑监测并记录大鼠从入水开始到爬上平台的整个过程所需的时间(潜伏期)。若120 s内未爬上平台,将其放在平台上10 s,以强化记忆,再放回笼中,该大鼠潜伏期记为120 s。第2阶段为空间搜索实验(Spatial Probe Test),在第1阶段实验结束后第二天进行,实验时去除平台,然后从原来位置将大鼠面向池壁放入水中,记录60 s内大鼠穿越原有平台的次数[6、7]。

1.3 指标测定

1.3.1 海马NCAM mRNA的测定

取适量大鼠海马组织,采用Trizol法提取总RNA,测定总RNA含浓度和纯度,采用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。按TaKaRa试剂盒Prime ScriptTMReagent Kit反转录合成cDNA。大鼠的目的基因NCAM和内参基因β-actin的Real-time PCR扩增引物序列均参考林雪灵[7]等人研究设计的引物,本研究引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。Real-time PCR反应按TaKaRa试剂盒SYBR®Premix Dimer EraserTM步骤进行操作。反应结束后,采用2-△△CT方法计算基因相对表达[6,7]。

1.3.2 海马NCAM蛋白的测定

取适量海马组织,按1g组织/20μl裂解液(含PMSF)进行匀浆,冰水中静置30 min,收集裂解液并离心取上清液。用裂解液进行蛋白定量后,在100℃水浴锅进行蛋白质变性10 min。采用碧云天BCA蛋白浓度测试试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳分离、转膜,将转膜好的PVDF膜置于5%BSA室温封闭1 h后,孵育一抗(浓度为1∶2 000),振摇,4℃过夜。使用辣根过氧化物酶标记的二抗检测目标蛋白[6,7]。

1.4 数据处理

应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析,所有数据均用均数±标准差(s)表示,组间比较采用方差分析,P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 体重变化情况

在游泳运动期间,每天对SD大鼠进行体重检测,取运动前和每周末的体重,由表1可知:与C组比较, HL组第5-7周末体重均非常显著性低于C组并具有统计学意义；与CM组比较,HLM组第5-7周末体重均非常显著性低于CM组并具有统计学意义,第2、4周末体重均显著性低于CM组并具有统计学意义。

表1 各组大鼠体重每周末变化情况(单位:g)

2.2 Morris水迷宫检测结果

2.2.1 定位航行平均逃避潜伏期检测结果

利用Morris水迷宫进行定位航行,由表2可知, CM和HLM组的各组大鼠的平均逃避潜伏期逐渐缩短。经单因素方差分析,两组在前3天的空间探索逃避潜伏期与后5天的学习记忆都有非常显著性差异并具有统计学意义,第5-7天无显著性差异；第8天后基本趋于稳定。CM组第2～10天平均逃避潜伏期均非常显著短于第1天(P＜0.01),第7、9天平均逃避潜伏期均非常显著性短于第2天并具有统计学意义,第5-10天平均逃避潜伏期均显著性短于第2天并具有统计学意义；HLM组第2～10天平均逃避潜伏期均非常显著性低于第1天并具有统计学意义,第5-10天平均逃避潜伏期均非常显著性短于第2天并具有统计学意义,第3、4天平均逃避潜伏期均显著性短于第2天并具有统计学意义。与CM组相比,HLM组第9、10天平均逃避潜伏期均长于CM组并无统计学意义。

表2 CM和HM组定位航行平均逃避潜伏期(单位:s)

2.2.2 空间探索平均穿越次数检测结果

利用Morris水迷宫进行的空间探索实验中,HLM组平均穿越次数(0.41±0.14)多于CM组(0.50±0.25,P＜0.05)并无统计学意义,但表现出对原有平台的搜索。

2.3 大鼠海马NCAM mRNA表达结果

SD大鼠海马NCAM基因检测结果(表3)与C组相比,HL组基因表达(0.86±0.04)显著高于C组(0.65±0.04,P＜0.05)并具有统计学意义。

2.4 大鼠海马NCAM蛋白表达结果

SD大鼠海马NCAM蛋白检测结果(表3)与C组相比,HL组蛋白表达(0.41±0.02)显著高于C组(0.27±0.01,P＜0.05)并具有统计学意义。

表3 海马NCAM mRNA与蛋白表达变化

3 讨论

3.1 长期大负荷运动对大鼠体重的影响

本研究实验结果证明,7周游泳运动后大鼠体重虽然都有所增加,但是空白对照组大鼠体重的增加速率明显大于大负荷运动组。我们可以推断:一方面,长时间大负荷运动消耗了机体大量能量,代谢相应增加,进而减少了脂肪及蛋白质在体内的合成；另一方面由于运动过度,食欲下降,从而减少了能量的摄入,所以空白对照组大鼠的体重增加相对缓慢。提示随着运动时间的延长和运动负荷的增加,大鼠体重的增加速率也就越缓慢,证明本课题游泳运动造模比较成功。

3.2 长期大负荷运动对大鼠空间学习记忆的影响

20世纪80年代初,Morris水迷宫是英国心理学家Morris设计的,并应用与脑的学习记忆机制的研究。该迷宫系统是测定动物空间位置觉和方向觉(空间定位)的学习记忆能力的行为较为理想的实验模型。此后,在神经生物学领域的基础和应用研究中被广泛运用[8]。在本实验中发现,随着Morris水迷宫训练时间的推移,CM组与HLM组大鼠的逃避潜伏期的时间越来越短。CM组与HLM组的测试结果尽管没有显著性差异,但HLM组的定位航行平均逃避潜伏期非常不稳定,随负荷的增加所需时间长于CM组,说明随游泳运动负荷的递增,导致大鼠空间学习记忆能力下降。此结果提示我们长期大负荷游泳运动后,影响或阻碍了大鼠空间学习记忆的形成。这与国内外相关研究结果一致[9-10]。如周慧[11]等人应用MG-3Y型迷宫对小鼠的学习记忆能力进行测试,发现高运动负荷组与对照组相比总电击时间、总训练次数、错误反应次数均明显增加,正确反应率显著下降,表明过高的运动负荷降低了大鼠的学习记忆能力。

3.3 长期大负荷运动对SD大鼠海马NCAM的影响

在1976年,Rutishauser等首先在鸡的视网膜和脑中发现神经细胞粘附分子(NCAM),它是细胞表面糖蛋白大家族的一组成员,介导细胞粘附和识别的胞膜糖蛋白、影响神经发育及损伤修复、神经通路的形成、信号传导过程、学习记忆形成、突触可塑性及重塑等多个神经身体过程[12、14]。

研究结果表明,不同运动负荷、方式与方法等都可能对机体造成不同的影响,而对海马中NCAM与学习记忆的作用和意义主要集中在适量运动或有氧运动。如袁琼嘉[6]等研究发现SD大鼠长期适宜运动后,长期中等负荷运动组海马NCAM的基因和蛋白均显著高于空白对照组,说明长期适宜的有氧运动提高了大鼠的空间学习记忆能力。而在长期大负荷运动中研究甚少,本实验研究结果表明,HL组大鼠海马NCAM基因和蛋白均明显高于C组。长期大负荷运动后,海马内NCAM诱导生成有所升高,通过突触重塑、轴突再生的促进作用但无中等负荷运动的效果好[6],这可能与海马组织损伤有一定的关系。随着运动负荷的增加,一方面,神经冲动的传导速率增加、神经递质释放增多,进而导致神经“兴奋毒性”；另一方面,能源物质的大量消耗、ATP合成速率下降,进而导致“能量耗竭”等。近来研究也表明,在神经受损后,PSA-NCAM的表达会增加,NCAM可能参与了损伤后神经的修复[15]。张晓岩[16]等研究发现高原低氧应激反应后,大鼠海马CA1区神经细胞NCAM基因表达先降低后升高,提示在高原低氧条件下可以通过上调NCAM mRNA表达,增加NCAM蛋白的合成,从而起到保护修复作用。

4 结论

(1)通过7周大负荷游泳运动,虽然大鼠逃避潜伏期缩短了,空间探索穿越次数有所增加,但随负荷增加,大鼠表现就越不稳定,可能影响或阻碍了大鼠空间学习记忆的形成。

(2)通过7周大负荷游泳运动,运动组海马NCAM的mRNA和蛋白表达都有不同水平的增高。提示可能参与了损伤后神经的修复,其原因及机制还有待进一步的研究。

参 考 文 献

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Effect of Long-Term Heavy Load Exercise on the Spatial Learning and M emorizing Abilities and NCAM in Rats'Hippocam pus

YUAN Qiong-Jia,et al
(Chengdu Sport University,Chengdu Sichuan,610041)

Objective:The purpose is to investigate the effect of long-term heavy load swimming exercise on the spatial learning andmemorizing abilities and the expression of neural cell adhesionmolecule(NCAM)in hippocampus of SD rats.Methods:40 male ratswere randomly divided into 4 groups as follows(n=10 in each group):control group (C),control group and Morrismaze(CM),and both were conventionally bred without intervening；7 weeks ofmoderate swimming exercise were given to heavy load exercise group(HL)and Morrismaze group(HLM).After 7 weeks,the brain of the C and HL group's ratswere taken out to test themRNA and protein of NCAM through real-time PCR and Western Blotting.The navigation and space exploration ability of CM and HLM were tested through Morriswatermaze. Results:1.In the period of swimming,the weight of HL group rats was significantly lower than that of C group at 5,6 and 7 weekends(p＜0.01)；the weight of HLM group ratswas significantly lower than that of CM group at4,5,6 and 7 weekends(P＜0.05,P＜0.01).2.After Morrismaze training,the early 3 days evasion incubation period of the two groups and the last5 days ability of learning and memory had a significantly difference(p＜0.01).The average escape latency of CM group from 2 to 10 dayswas significantly lower than the first day(p＜0.01),and it became significantlylower from 3rd to 10th days than the second day(p＜0.05,p＜0.01)；the average escape latency of HLM group from the 2nd to 10th dayswas significantly lower than the first day(p＜0.01),and itwas significantly lower from 4th to 10th days than the second day(p＜0.05,p＜0.01).After Morrismaze training,the average traversing times of HLM group weremore than those in CM group(p＞0.05).3.The expression of NCAM gene and protein of the HL group ratswere significantly more active than the C group rats(P＜0.05).Conclusion:Although 7-weeks of long-term heavy load exercise can shorten the evasion incubation period of locating swimming and enhance the passing frequency of spatial exploring of rats,within the increase of load and the accumulation of fatigue,the rats behavedmore unstably and itwill affect the formation of learning andmemory in rats；long-term heavy load exercise is conducive to the promotion of NCAM expression in rats hippocampus,which shows that themechanism may be associated with the repairmen of injured nerves.

exercise；learning；memorizing；hippocampus；NCAM

G804.2

:A

:1001-9154(2014)11-0079-05

G804.2

:A

:1001-9154(2014)11-0079-05

国家自然科学基金(31371202)；四川省科技厅科技支撑计划项目(2012SZ0067)；国家体育总局、四川省运动医学重点实验室；四川省高校科研创新团队专项基金。

袁琼嘉(1956–),女,重庆北碚人,教授,博士,博士生导师,研究方向:运动与健康促进。

2014-08-10