黄酒苦味影响因素分析

邱修柄，成 坚*，肖丽琼，李勇波

（仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225）

黄酒以大米、黍米为原料，一般酒精含量为14%vol～20%vol，属于低度酿造酒。黄酒含有21种氨基酸，其中包括数种未知氨基酸，且8种必需氨基酸黄酒都具备，故被誉为“液体蛋糕”。但是在品评黄酒的过程中，经常遇到酒的“后味”偏苦，针对这个问题，本次试验通过从酿酒原料、酒曲添加量、酒药添加量和主发酵温度4个因素研究对黄酒的苦味影响，以改善黄酒风味。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

精白糯米、糙白糯米、精黑糯米、糙黑糯米、精白粳米、酒曲、酒药：梅州市成氏酒业提供；2-辛醇：美国Sigma公司；甲醇、乙腈、乙醇（分析纯）：瑞典欧谱生公司；酪醇标品、冰乙酸分析纯、NaCl（分析纯）、0.5%对二甲胺基苯甲醛一硫酸溶液、混合氨基酸标准品、衍生剂邻苯二甲醛（o-phenylenediamine，OPA）、氯甲酸芴甲酯（fluorenylmethy chloroformate，FMOC）及硼酸盐缓冲溶液、磷酸二氢钠、福林酚试剂甲、乙液、牛血清蛋白（分析纯）：广州化学化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

PHS-25PH计：上海虹益仪器仪表有限公司；LRH-150生化培养箱：韶关市鑫腾科普仪器有限公司；FA1004磁力加热搅拌器：金坛市富华仪器仪表有限公司；电热恒温水浴锅：广州市康恒仪器有限公司；YBFJ-110酒精计：河北省故仙粤兴玻璃仪表厂；1100型高效液相色谱仪、4.6mm×150mm 5-Micron 氨基酸分析柱、4.6mm×250mm×5μm ZORBAX Eclipse Plus C18柱：美国安捷伦科技有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂；721分光光度计：上海精密仪器科学有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黄酒加工工艺流程

1.3.2 苦味值的测定

感官评定方法：感官评定小组由5人组成，评定员用蒸馏水漱口之后，取待评定液2mL入口中，10s后吐出，漱口后取与之味道相近之标准液品尝，如确认两味近，即可将待评定液的苦味值定为该标准液的苦味值，否则需取其他标准尝，直至确定苦味值。取5人评定的平均值。标准液：按MOGENSEN L等[1]，的方法配制，以奎宁为基准，经评定a（a=3×10-6mol/L）为下限，刚好没有苦味；32a为上限，再增加苦味基本上不增加；中间溶液浓度成倍增加，苦味值也相应增加。评分标准如表1所示[2]。

表1 苦味值的评分标准Table 1 Evaluation criteria of bitterness

1.3.3 黄酒中醇酯类的测定[3]

样品处理：聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）萃取头使用前先在气相色谱进样口275℃活化30min；于50mL容量瓶中加入正辛醇（2.59mg/mL，作为内标）0.4mL，用酒样稀释至刻度，再移取5mL酒样于顶空瓶中，并加入1.5g NaCl，旋紧盖子密封，将PA萃取头及顶空瓶在55℃磁力搅拌器上搅拌30min，取出萃取头，进行GC/MS分析。

GC条件：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25mm）毛细管柱。程序升温：起始温度为55℃，保留3min，以4℃/min的速度升至140℃，最后以15℃/min的速度升至220℃，后运行10min。进样口温度：220℃；GC进样解吸时间：10min。分流比：10∶1；载气：He；流量为1mL/min。

MS条件：离子源：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量：70eV；全扫描。检测器温度：220℃。

1.3.4 黄酒中杂醇油含量的测定[4]

无杂醇油乙醇制备：取0.1mL按GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准》中操作方法检查不显色，如果显色需进行处理。杂醇油标准溶液：称取0.080g异戊醇和0.020g异丁醇于100mL容量瓶中，加无杂醇油乙醇50mL，再加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于1mg杂醇油，置低温保存。吸取杂醇油标准溶液5.0mL于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.1mg杂醇油。

操作步骤：

（1）样品管及标准管的准备：吸取0.5mL酒样于10mL比色管中为样品管，再分别吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.0mL杂醇油标准使用液（相当于0mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg杂醇油）置于10mL比色管中。

（2）分析：分别于样品管及标准管中各准确加水至1mL，摇匀后放入到冷却水中沿管壁加2mL对二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液，同时摇匀后放入沸水浴中加热15min后取出，立即放入冰浴中冷却，立即各加2mL水混匀，冷却10min后用1cm比色皿以零管调零，于波长520nm处测吸光度值，绘制标准曲线进行定量分析。

1.3.5 黄酒中酪醇的测定[5]

样品的处理：超声脱气过的酒样直接上样。

色谱条件：C18柱，柱温30℃；甲醇-水-冰乙酸（40∶59∶1，v/v）溶液为流动相，流速0.75mL/min，检测波长280nm，进样量1～10μL，采用峰面积外标法定量。

标准物质的配制：以体积分数20%的酒精为溶剂，配制酪醇100mg/L标准储备溶液。将标准储备溶液分别进样1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL，以峰面积为横坐标，标准物质质量浓度为纵坐标，进行线性回归分析。

1.3.6 黄酒中氨基酸的测定[6-7]

样品处理：取约10mL的酒样，离心后，用纯水稀释10倍，用1%的活性炭脱色10s左右，用滤纸过滤后取滤液用0.45μm的滤膜过滤，放入小瓶压盖作为供试品，待测游离氨基酸。

氨基酸色谱分析条件：采用柱前OPA、FMOC衍生化，梯度洗脱的方式进行色谱分析；色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。

流动相A：0.04mol/L NaH2PO4缓冲溶液（pH7.8）；流动相B：乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10，v/v）。

洗脱程序：时间T（min）/流动相B（%）：0/0；1.9/0；18.1/57；18.6/100；22.3/100；23.2/0；26/0；检测波长：338nm（OPA）；262nm（FMOC）；柱温：40℃；流速：2mL/min。

1.3.7 黄酒中苦味肽的测定[7-8]

样品处理：各取酒样50mL加入50mg单宁酸，搅拌30min后静置过滤，弃去初滤液5mL，吸取30mL滤液加入30mL异丁醇萃取10min，静置吸取醇相1mL于50mL容量瓶中定容。此液为样品稀释液。

福林酚试剂甲：将溶液A 50mL和溶液B 1mL混合即成，现用现配。

溶液A：1g Na2CO3溶于50mL的0.1mol/L NaOH溶液中。

溶液B：将1%硫酸溶液和20g/L酒石酸钾钠溶液等体积混合而成。

牛血清蛋白：精确称取牛血清蛋白，配制成100μg/mL溶液。

分析步骤：吸取样品稀释液1mL，加入试剂甲3mL，置于25℃中水浴保温10min，再加入试剂乙0.3mL，立即混匀、保温30min，以介质溶液调零，测定A750nm值，与蛋白质标准液作对照，求出样品的苦味肽含量。

2 结果及分析

2.1 原料对苦味的影响

以糙白糯米、糙黑糯米、精白糯米、精黑糯米为原料生产酒基测定其苦味值及苦味成分。从表2可知，糙米的高级醇、苦味氨基酸以及苦味肽、糠醛的含量都稍高精白后的米，而黑糯米的苦味物质又稍高于白糯米的苦味物质。由于精白米脱去了果皮种皮糊粉层，所以蛋白质含量低于糙米，蛋白质含量高，发酵生成的氨基酸、高级醇含量就高，具苦味的氨基酸含量也增加。且糙米米皮中的半纤维素、多缩戊糖在发酵和杀菌受热生成糠醛等物质，使酒具苦涩味。因此以糙米为原料的黄酒其苦味物质普遍多于精米所酿黄酒。黑糯米的蛋白质含量比普通早籼米的蛋白质含量高10.4%，比普通的晚籼米高22.1%[10]。因此黑糯米中的苦味物质较白糯米高，黑糯米中的强心苷、生物碱、植物甾醇等多种生理活性物质都是具有苦味的物质，所以其苦味值较白糯米高，但其营养价值较白糯米高。原料蛋白质含量的控制，能够降低黄酒的苦味值，因此适当提高米的精白度，并除去米糠、麦杆、麦壳等杂质能降低其苦味值[9]。

表2 不同原料黄酒苦味成分表Table 2 Bitter ingredients in different rice wine

2.2 酒曲用量对苦味的影响

从表3可以看出，当酒曲添加量较大时，酒曲中酸性蛋白酶和酸性羧（基）肽酶数量较多，主发酵时生成氨基酸、高级醇数量多且各种霉菌孢子后期大量自溶入酒内，霉菌孢子给酒产生强烈苦味，给黄酒带来较重苦味；当酒曲添加量较少时此2种酶数量少，则酵母繁殖缓慢，发酵不正常，酵母繁殖缺少营养将导致细胞提早自溶，产生苦味氨基酸，苦味肽含量将偏高，影响黄酒风味和稳定性。另外随着酒曲用量的增加苦味肽含量略有减少，其原因是酒曲中能分解肽的酶有所增加[10-11]。

表3 不同酒曲量黄酒苦味成分Table 3 Bitter ingredients rice wine with different koji addition

2.3 主发酵温度对苦味的影响

主发酵温度较高，则酵母的繁殖倍数增加，酵母发酵过程中能将更多的氨基酸转换成高级醇。而且温度适当的提高能使发酵过程中产生的酶的活力提高，从而将更多的氨基酸转换成高级醇。从表4可以看出，随着发酵温度的升高，苦味肽含量略有降低[12-13]。

表4 不同主发酵温度黄酒苦味成分表Table 4 Bitter ingredients of rice wine with different fermentation temperature

2.4 工艺优化[14-16]

以酒药添加量、酒曲添加量、主发酵温度为因素，苦味值为考察指标设计3因素3水平的正交试验，因素水平见表5，结果见表6，方差分析见表7。

表5 黄酒发酵条件正交试验因素水平Table 5 Factors and levels of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

表6 黄酒发酵条件正交试验结果Table 6 Results and analysis of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

表7 黄酒发酵条件正交试验方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

由表7可得，各因素指标的极差均大于空列的极差，所以A、B、C各因素的效应都存在。由方差分析可看出，各因素均没有显著性影响。其原因可能是由于试验主观因素较大，且因素的自由度都较小，使检验的灵敏度降低，从而掩盖了考察因素的显著性判断。但仍然可以看出，各因素对黄酒苦味影响的大小依次为C＞B＞A。因此按照各因素的最好水平选取出最好的水平组合为C2B2A2，即主发酵温度均为30℃；酒曲添加量为10%，酒药添加量为0.8%。在此最佳发酵工艺条件下进行3次验证试验，成品苦味值评分平均值为2.3。

3 小结与讨论

3.1 糙米的高级醇，苦味氨基酸以及苦味肽的含量都稍高精白米，而黑糯米的苦味物质又稍高于白糯的苦味物质。

3.2 随着酒药用量的增加高级醇含量先减少再增加，而苦味氨基酸则先增加后减少。

3.3 当酒曲添加量较大时，主发酵时生成氨基酸、高级醇数量则多；当酒曲添加量较少时此两种酶数量少，产生苦味氨基酸，苦味肽含量将偏高。

3.4 主发酵温度较高，酵母发酵过程中能将更多的氨基酸转换成高级醇；随着发酵温度的升高，苦味肽含量略有降低。

3.5 酒药添加量、酒曲添加量、主发酵温度各因素的效应都存在。各因素对黄酒苦味影响的大小依次为主发酵温度＞酒曲添加量＞酒药添加量。最好的水平组合为主发酵温度30℃；酒曲添加量10%，酒药添加量0.8%。

[1]MOGENSEN L,ADLER-NISSEN J.Evaluating bitterness masking principles by taste panel studies[C].Frontiers of Flaver Proceeding of the 5th International Flavor Conference Porto Karras,Chalkidiki,1987.

[2]唐慧敏，任 麒，沈慧凤.苦味评价方法的国内外研究进展[J].中国新药杂志，2009，18（2）：127-131.

[3]殷德荣.毛细管气相色谱法测定绍兴黄酒中挥发性物质[J].中国卫生检验杂志，2006，16（8）：929-931.

[4]高 敏，曾新安，于淑娟.荔枝酒中杂醇油含量的测定[J].食品工业科技，2010（5）：356-358

[5]FRIÍAS S,CONDE J E,RODRI?GUEZ-BENCOMO J J,et al.Classification of commercial wines from the Canary Islands (Spain) by chemometric techniques using metallic contents[J].Talanta,2003,59(2):335-344.

[6]王 娟，缪震元，吴岳林，等.高效液相色谱分析对羟基苯乙醇含量[J].精细化工中间体，2003，33（6）：58-59.

[7]钟其顶，高红波.PITC 柱前衍生高效液相色谱法测定黄酒中17 种氨基酸方法研究[J].酿酒，2010，37（5）：74-76.

[8]武彦文，欧阳杰.氨基酸和肽在食品中的呈味作用[J].中国调味品，2001（1）：21-24.

[9]孟中法，谢广发.重视黄酒肽类物质的研究[J].酿酒科技，2004（3）：77-78.

[10]夏艳秋.优质黄酒菌种、原料及发酵工业的研究[D].江苏：扬州大学硕士论文，2004.

[11]方 华.绍兴黄酒麦曲中微生物的初步研究[D].无锡：江南大学硕士论文，2006.

[12]寿泉洪.浅论温度对黄酒生产的影响[J].酿酒，2003，30（3）：47-49.

[13]权美平.黄酒的生产工艺及其稳定性的研究[D].西安：陕西师范大学硕士论文，2005.

[14]顾国贤.酿造酒工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，1996.

[15]孙俊良.糯米酒最佳发酵工艺条件的研究[J].酿酒，1998（2）：54-55.

[16]徐呈祥.黄酒酿造新工艺新技术研究[J].酿酒，1993（6）：27-29.