野生苹果酒产香酵母的分离及筛选

赵海霞，华惠敏，吴桂君

（银川能源学院 生物与农业工程学院，宁夏 永宁 750105）

近年来，苹果酒因含有苹果与生物发酵所产生的双重营养成分，具有抗衰老、软化血管降血脂及美容养颜等保健作用[1]而受到越来越多的消费者青睐。目前，我国生产苹果酒使用的酵母多为葡萄酒等其他果酒专用酿酒酵母，而缺少苹果酒专用发酵菌种，而优良苹果酒的发酵不是仅由单一酵母完成的，单一酵母往往会造成产品风味上的缺陷，口味较平淡[2]。所以人们试图利用具有增加苹果酒香气风味的非酵母属酵母和具有高发酵效率的酵母属酵母进行混合发酵酿造苹果酒，既增加苹果酒中的酯香物质含量，同时又保证了用于苹果酒发酵的酵母具有较高的发酵效率。果酒发酵中赋予酒香的酵母被称为产香酵母，如孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、克勒克酵母属（Klaeckera）、假丝酵母属（Candida）和毕赤酵母属（Pichia）等[3]。它们在发酵过程中产生一些高级醇、低级脂肪酸和酯类等芳香物质，使得果酒气味芬芳，果香浓郁[4]。

因此，本文针对苹果酒酿造中所需菌种缺乏的现状，通过测定从自然界分离的4株产香酵母对160 mg/L的SO2和10%vol酒精度的耐受性后，与酿酒酵母进行混合发酵试验，选出J-4号菌更适合作为苹果酒酿造的产香酵母。其发酵所得苹果酒品质优，且酒的香味浓郁，风味饱满，酒体醇厚，具有苹果酒的典型风味，适用于果酒生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤：采自宁夏银川市永宁县小任果业苹果园中；红富士苹果：购自永宁县小任果业。

“安琪”果酒用高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司生产；N号酿酒酵母：北方民族大学国家民委重点实验室提供。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固体培养基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，琼脂2%。

YEPD液体培养基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。

发酵培养基：宁夏红富士清洗、破碎、榨汁，用白砂糖调整果汁糖度，使含糖量为216g/L，用酒石酸、碳酸钙调整果汁的酸度，使酸含量为（以酒石酸计）6 g/L，添加H2SO3（按6%添加量），使SO2含量为80 mg/L，采用巴氏消毒法灭菌，65℃30 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IF超净工作台：苏中净化设备有限公司；（LED）XSP-10C显微镜：上海永亨光学仪器制造有限公司；756MC型紫外可见光分光光度计：上海舒耀仪器设备有限公司；SHP-250型智能生化培养箱：上海鸿都电子科技有限公司；LDZX-50KBS立式蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；HR-200电子分析天平：日本A&D 公司；DELTA320 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；微量可调式移液枪：Gilson；BCD-219D冰箱：青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分离

无菌称取10 g土壤放入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，制成菌悬液，以10-3、10-4、10-5及10-6为浓度梯度，每皿接种量200 μL的接种量，每浓度3个平行进行YEPD固体涂布分离酵母菌。

1.3.2 产香酵母的筛选

产香酵母的初筛：将分离出来的酵母菌株，接种YEPD液体培养基活化后接种到YEPD固体培养基28 ℃培养48 h后观察，筛选出能产气味的菌株。

传代培养：筛选的野生酵母一般性能不稳定，为了保证后续试验的顺利进行，将已经纯化的产香酵母进行传代培养5～6次，将性能稳定优良的菌种进行YEPD培养基斜面保存。

1.3.3 产香酵母的性能测定[5]

对初次筛选的产香酵母进行耐SO2及耐酒精性进行测定。

（一）耐酒精能力的测定

配置YEPD液体培养基使酒精度分别为8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol；将各梯度培养液分别分装，每支试管装液量10 mL，每个菌种做3个平行，每管中接入菌悬液0.5 mL，菌悬液浓度为107个/mL。以安琪牌果酒酿酒酵母为对照，32 ℃，180 r/min进行摇床培养24 h后600 nm处测定吸光度值，用比浊法测定菌体生长量以确定酵母菌的耐酒精能力并进行美兰染色镜检。

（二）耐SO2性能的测定

分别配置SO2含量为100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液体培养。分别分装，每支试管装液量10 mL，每个菌种做3个平行，以安琪牌果酒酿酒酵母为对照，32 ℃，180 r/min进行摇床培养24 h后600 nm处测吸光度值，用比浊法测定菌体生长量以确定酵母菌耐SO2的性能。

1.3.4 产香酵母的复筛

将初筛出的各产香酵母与N号菌按1∶1混合，同时，以“安琪”果酒专用高活性干酵母为对照K，分别接种于发酵培养基，接种量为250 mg/L，室温发酵，测定其还原糖、滴定酸的变化，当其还原糖含量＜5 g/L时，用蒸馏比重法测其酒精度，并对其进行感官评定，主要是评定各菌种在有酒精产生的环境中，芳香物质的产生情况，筛选出适合苹果酒酿造的产香能力强的菌种。

1.3.5 酵母的分子鉴定

取0.2 g左右研磨好的样品，采用KI法[6]提取基因组DNA，-20 ℃保存备用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

ITS扩增及检测：参照ITS通用引物序列[7]及GenBank中登录的Cortinarius属rDNA ITS序列，设计引物对序列为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由TaKaRa公司进行合成。

50 μL扩增体系：10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTP 2.5 μL，引物各1 μL，模板0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 39 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min。反应完成后，加6×上样缓冲液混匀，于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.6 测定方法

还原糖测定方法[8]：斐林试剂法。

酸的测定方法[8]：酸碱中和滴定法。

酒精度测定方法[8]：蒸馏比重法。

果酒感官评定[9]：依据GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中果酒感官评定表对其进行打分。

2 结果与分析

2.1 产香酵母初筛结果

根据菌落形态、显微观察以及平皿的香味评定初次筛选出5株形态、香味各异的酵母菌。

表1 5株酵母菌菌落特征与菌体形态Table 1 Colony morphology and mycelial morphology of 5 strains

从表1看出J-3在固体平板上培养，散发出异臭味被淘汰，其他菌用斜面保存备用。

2.2 产香酵母的性能测定结果

（1）产香酵母对酒精耐受力的测定结果：

在一定浓度范围内，菌悬液中细胞浓度与液体光密度成正比，与透光度成反比，通过比浊法测培养24 h后菌的浓度来反应各菌在不同浓度酒精培养基中的生长情况。由图1看出，产香酵母在含10%vol酒精的液体培养基中，4株菌的OD值均＞0.10，4株产香酵母在此酒精浓度中菌体生长良好，为了更好的确定4株菌的形态和出芽情况，进行了美蓝染色的酵母菌死活细胞鉴定，镜检结果见图2。由图2可知，4株菌出芽情况好且活细胞多。产香酵母的耐酒精能力到10%vol，而果酒的酒精度一般＜10%vol，故而4株菌均适用于苹果酒的酿造。在其他浓度14%vol～16%vol中OD值的波动较大，甚至出现OD值＜0.10的情况，菌体的长势参差不齐。在苹果酒发酵过程中，酵母代谢的主要产物是乙醇，酒精度过高会对产香酵母的新陈代谢产生抑制作用[10]，因此具有酒精抗性的产香酵母有利于苹果酒混合发酵的顺利进行。

图1 产香酵母对酒精耐受力的测定结果Fig.1 Ethanol tolerance of aroma-producing yeast

图2 4株菌在10 %vol酒精液体培养基中美蓝染色结果Fig.2 Dyeing results of 4 strains cultured in 10 %vol alcohol liquid medium with methylene blue

（2）产香酵母对SO2的耐受性的测定结果：

从图3中看出，4株产香酵母分别在SO2含量为100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液体培养基中测得OD值均0.25，且都耐受160 mg/L SO2，其中J-1和J-2在4个含SO2浓度梯度的培养基中测得的OD值在0.3左右，菌体生长慢，J-4和J-5 在4个含SO2浓度梯度的培养基中测得的OD值在0.65左右，菌体生长快。SO2具有光谱抗菌活性，在果酒酿造中主要起杀菌的作用。在一定浓度下，SO2可以抑制或杀死酵母细胞。在苹果酒酿造过程中，对SO2有较高耐受力的产香酵母更适合作为酿酒菌种，因此J-4和J-5更适合果酒酿造。

图3 产香酵母的耐SO2能力Fig.3 SO2resistant capacity of aroma-producing yeast

2.3 产香酵母复筛结果

2.3.1 发酵过程的还原糖变化

用菲林试剂法测定发酵过程中还原糖的变化，从图4可以看出，各个菌发酵过程中还原糖逐渐减少，发酵过程顺利稳定进行。J-5菌因在发酵结束后糖含量为9.1g/L，与其他菌相比较，还原糖含量较高、发酵能力较弱而被淘汰。J-1、J-2、J-4菌发酵结束后还原糖含量＜4 g/L，有较强的发酵能力，但J-1和J-2耐受SO2的能力较差，所以J-4在整个发酵过程中较其他筛选菌发酵能力较强，更适合作为苹果酒的酿造菌。

图4 发酵过程的还原糖含量变化Fig.4 Reducing sugar changes during fermentation process

2.3.2 果酒的感官评定

从表2中看出，J-1、J-2和N号酿酒酵母混合发酵，酒精度低，感官评定结果差，香味不佳；J-4、J-5和N号葡萄酒酿酒酵母混合发酵，酒精度较前两者高，感官评定结果好，苹果香味浓，尤其是J-4号菌，综合评定得分最高，确定出J-4号菌为苹果酒酿造的最佳产香酵母。

表2 苹果酒评定结果Table 2 Evaluation result of cider

2.4 J-4菌分子鉴定结果

分子测序结果：

5′-GGGATGGCATCTACTGATTTGAGGTCAACTT GATGATATTAAAAGCAACCCTTTGCCTAAGGTACAT TACCATTTCCCTTGTAAAGTAAAACGAATAAATCCA TAAATACATCACAGCGAGAACAGCGTCTCCAAAGA AGCTAAGTGTTGAATTAAAAAAGACTGAAACAGTC TCCAATTTCAAGCTAACCCTGAGTATCGCCCACAAC CAAAAGTTAATAAATTATCTTTTGAGAAGGAAATG A CGCTCAAACAGGCATGCCCCTGAGAATGCTCAAG GGCGCAATGTGCGTTCAAAAATTCAATGATTCACGA GTATCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTA CGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTG TTGAAAGTTTTAAATTATTT TAAAATTTCCGTTAGG AATTTTGGTTTAGTTTAAAAAATATAATAAAATATA ACTGTTTGTGTTTGTTTTTTGCCTTGAACCTTTCGAT TCAAAGCAGAAAGAATTAAATTAAAGTAAAAAACT CCAATGGGGG-3′。

根据测序结果和NCBI数据库检索可知：J-4号菌，其序列与Genebank上Hanseniaspora thailandicaAB501147.1相似度达到99%，认定该菌为孢汉逊酵母属。本属的真菌有别于其他酵母菌的主要特征，发酵力强，产酯香良好，可增加酿造产品的风味[11]。

3 结论

通过初筛、复筛，获得1株适用于苹果酒发酵用的产香酵母J-4。经初步的发酵试验综合评价，J-4号菌是适合苹果酒酿造的产香酵母。分子测序结果显示，该菌属于孢汉逊酵母属。对菌株J-4进行苹果酒发酵的工艺条件，如酿酒酵母的添加量及两者最佳比例、糖浓度、发酵时间、发酵速度、降糖能力、产酒精能力及温度等一系列的研究将在后续试验中继续进行，从而为完善我国苹果酒酿造工艺及酿造菌种提供依据。

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