小麦抗性淀粉含量测定方法研究

游倩倩，黄继红，2*，冯军伟，苏雪锋，王 文，杨铭乾

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省食品工业科学研究所，河南 郑州 450003）

0 前言

抗性淀粉（resistant starch，RS）的概念由英国生理学家Englyst 于1982 年提出，1993 年欧洲抗性淀粉协会（EURESTA）将其定义为“健康者小肠中不被吸收的淀粉及其降解产物的总称”.抗性淀粉能降低胰岛素反应，对II 型糖尿病有缓解作用[1-3]，调节机体能量摄入，控制体质量[4-5]，因此在人类健康饮食的研究和生产中具有广阔前景.世界卫生组织等机构1998 年联合出版的《人类营养中的碳水化合物》一书中指出：“抗性淀粉的发现和研究进展，是近年来碳水化合物与健康关系的研究中的一项重要成果.”

抗性淀粉检测目前尚无国标，检测方法有一定差异，主要有体内法和体外法，体内测定法是用活体肠道消化样品然后测定未消化的淀粉含量，这种方法费时、成本高，不适合大量样品的测定，同时有研究发现人体本身的年龄、生理状况及生活环境也会造成淀粉消化能力的差异，因此目前的抗性淀粉测定方法以体外法为主.体外测定法的基本原理大多是使用α-淀粉酶水解样品，再直接测定残余物中未分解的淀粉量，或通过测定样品总淀粉和可消化淀粉的含量，以两者差值表示抗性淀粉含量.α-淀粉酶种类广泛，包括胰α-淀粉酶、中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶，作者通过使用不同种类α-淀粉酶对比测定效果，同时考虑抗性淀粉中蛋白质的影响，确定小麦抗性淀粉测定的最佳方法.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

小麦淀粉：河南省天存小麦改良技术研究所；国民淀粉260：国民淀粉工业（上海）有限公司；普通胃蛋白酶：国药集团化学试剂有限公司；耐高温α-淀粉酶、普鲁兰酶：财鑫集团；中温α-淀粉酶：北京奥博星生物技术有限责任公司；猪胰腺α-淀粉酶：sigma 公司；抗性淀粉试剂盒：爱尔兰Megazyme 公司；3，5-二硝基水杨酸、顺丁烯二酸均为化学纯；无水葡萄糖、无水乙醇、迭氮钠、氢氧化钾、冰醋酸、氢氧化钠、二水氯化钙均为分析纯.

1.2 主要仪器和设备

LDZX-50FB 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；GZX-GF-MBS-1（9053A）电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；FA1204B 电子天平、723N 可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SHA-C 数显水浴恒温振荡器：金坛华峰仪器有限公司；TDZ5-WS 湘仪离心机：河南湘仪实验室仪器开发有限公司；TH-500 梯度混合器：上海沪西分析仪器厂；XL-30-ESEM 环境扫描电子显微镜：荷兰菲利普电子光学有限公司.

1.3 方法

1.3.1 小麦抗性淀粉制备方法

酶-压热法制备小麦抗性淀粉：称取一定量的小麦淀粉，加适量水混匀后加入耐高温α-淀粉酶，沸水浴10 min，取出后冷却，加入适量水和普鲁兰酶，50～60 ℃酶解过夜，放入高压蒸汽灭菌器，高温高压（121 ℃）处理一定时间，取出后自然冷却，低温（4 ℃）放置过夜，60 ℃鼓风干燥，粉碎.

1.3.2 Goni 法

称取100 mg 待测样品于50 mL 离心管中，加入10 mL KCl-HCl 缓冲液，再加胃蛋白酶溶液，充分混合，在40 ℃下水浴振荡60 min，冷却后加入9 mL Tris-maleate 缓冲液和胰α-淀粉酶溶液，充分混合，37 ℃下水浴振荡16 h，离心（3 000 r/min，15 min），去除上清液，用蒸馏水洗涤后，再次离心，去除上清液.所得沉淀用3 mL 蒸馏水润湿，加3 mL 4 mol/L KOH 溶液混合，室温振荡30 min，再加5.5 mL 2 mol/L HCl 和3 mL 0.4 mol/L 醋酸钠缓冲溶液，调节pH 至4.75，加葡萄糖淀粉酶溶液，混合，60 ℃水浴振荡45 min，离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液于容量瓶中，用10 mL 蒸馏水洗涤沉淀，离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，合并上清液，用水定容至50 mL.DNS 法测定葡萄糖含量，RS 含量=葡萄糖含量×0.9.

1.3.3 AOAC 法[6]

AOAC Official Method 2002.02.

1.3.4 中温α-淀粉酶法

称取100 mg 待测样品于50 mL 离心管中，加入10 mL KCl-HCl 缓冲液，再加胃蛋白酶溶液，充分混合，在40 ℃下水浴振荡60 min，冷却后加入9 mL Tris-maleate 缓冲液和中温α-淀粉酶溶液，充分混合，60 ℃下水浴振荡10 h，离心（3 000 r/min，15 min），去除上清液，用蒸馏水洗涤后，再次离心，去除上清液.所得沉淀用3 mL 蒸馏水润湿，加3 mL 4 mol/L KOH 溶液混合，室温振荡30 min，再加5.5 mL 2 mol/L HCl 和3 mL 0.4 mol/L 醋酸钠缓冲溶液，调节pH 至4.75，加葡萄糖淀粉酶溶液，混合，60 ℃水浴振荡45 min，离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液于容量瓶中，用10 mL 蒸馏水洗涤沉淀，离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，合并上清液，用水定容至50 mL.用GOPOD 试剂测定D-葡萄糖的含量.

1.3.5 耐高温α-淀粉酶法

称取100 mg 待测样品于50 mL 离心管中，加入10 mL KCl-HCl 缓冲液，再加胃蛋白酶溶液，充分混合，在40 ℃下水浴振荡60 min，冷却后加入9 mL 磷酸氢二钠缓冲液和耐高温α-淀粉酶溶液，充分混合，100 ℃下恒温振荡30 min，冷却至室温，调整pH 后加入葡萄糖淀粉酶，60 ℃水浴振荡60 min，冷却离心（3 000 r/min，15 min），去除上清液，用蒸馏水洗涤后，再次离心，去除上清液.所得沉淀用3 mL 蒸馏水润湿，加3 mL 4 mol/L KOH 溶液混合，室温振荡30 min，再加5.5 mL 2 mol/L HCl 和3 mL 0.4 mol/L 醋酸钠缓冲溶液，调节pH至4.75，加葡萄糖淀粉酶溶液，混合，60 ℃水浴振荡45 min，离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液于容量瓶中，用10 mL 蒸馏水洗涤沉淀，离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，合并上清液，用水定容至50 mL.用GOPOD 试剂测定D-葡萄糖的含量.

1.3.6 小麦淀粉与小麦抗性淀粉的微观形貌比较

将烘干的待测样品研碎，然后均匀分散于双面胶上并固定在铜台上，喷金后进行扫描电镜观察.

2 结果与分析

2.1 不同测定方法测定不同种类淀粉抗性淀粉的含量（表1）

表1 不同测定方法对不同样品的测定结果

Goni 法和AOAC 法均采用胰α-淀粉酶37 ℃酶解，Goni 法在淀粉酶酶解前有蛋白质酶解过程，模拟了人体消化的过程，消除了淀粉中的蛋白质对淀粉酶水解淀粉的影响，而AOAC 法在淀粉酶中添加了糖苷酶，避免淀粉水解产物（如麦芽糖、麦芽三糖）对胰α-淀粉酶活性的抑制，从两者的结果上看AOAC 法中胰α-淀粉酶的作用发挥更为有效，并且去除了胃蛋白酶消化过程，修改了一些参数，测定更为简便，在葡萄糖的检测方法上，Goni法采用DNS 法，AOAC 法中采用GOPOD 法，其中GOPOD 法又分为对RS 含量在10%以下和10%以上的不同计算公式，从小麦淀粉的RS 测定结果可以看出AOAC 法更为精确.

采用中温α-淀粉酶比胰α-淀粉酶酶解时间有所减少，试验中将中温α-淀粉酶法又分为有蛋白酶酶解过程和无蛋白酶酶解两个过程，可以看出蛋白质对测定结果有影响，但是，国民淀粉260和小麦淀粉有蛋白质酶解过程的RS 测定结果相对于无蛋白质酶解过程偏高，而试剂盒标样和小麦抗性淀粉有蛋白质酶解过程的RS 测定结果相对于无蛋白质酶解过程则偏低.

耐高温α-淀粉酶法在测定时间上更具优势，淀粉酶酶解时间只需30 min.测定试验也分为有蛋白酶酶解过程和无蛋白酶酶解两个过程，从测定结果看蛋白质对测定结果有影响，并且不同种类淀粉有蛋白质酶解过程的RS 测定结果相对于无蛋白质酶解过程均偏高.

2.2 方法的稳定性分析（表2）

表2 对小麦抗性淀粉淀粉不同测定方法重复性比较

由表2 可以看出，测定小麦抗性淀粉含量稳定性最好、精密度最高的是AOAC 法，Goni 法次之；其他测定方法中，无蛋白酶消化过程的重复性优于有蛋白酶消化过程，这是由于抗性淀粉测定的精细要求，多个步骤就会对测定重复性造成一定影响.

2.3 小麦淀粉与小麦抗性淀粉的微观形貌比较

小麦淀粉和小麦抗性淀粉的电镜照片见图1和图2.

图1 和图2 显示，小麦淀粉颗粒较完整，表面光滑，而通过酶解压热法制备的小麦抗性淀粉颗粒形状已经被破坏，形成不规则形状，表面不光滑且有一些褶皱和沟壑，从而具有了一定的抗酶解性.表1 中显示小麦抗性淀粉的测定结果随着酶解温度的提高而降低，推测是由于小麦抗性淀粉的这种不规则结构使其抗酶解性只在一定温度范围内有效，随着温度升高，其抗酶解性下降.

图1 小麦淀粉电镜照片

图2 小麦抗性淀粉电镜照片

3 结论

对小麦抗性淀粉的RS 测定，Goni 法和AOAC法的测定结果最高，其他方法推测是由于温度的影响从而使得结果偏低，而Goni 法和AOAC 法最接近人体消化过程，因此Goni 法和AOAC 法都可用于酶解压热后小麦淀粉的RS 测定.测定重复性也是Goni 法和AOAC 法最好，而AOAC 法又高于Goni 法，因此，AOAC 法是测定小麦抗性淀粉的首选方法.但是由于对抗性淀粉的测定方法研究较少，究竟哪种方法测量的结果比较准确，还要通过体内试验来验证.

［1］Dundas S M.The effect of resistant starch on metabolic indices of type II diabetes［D］.Canada:University of Guelph，2010.

［2］Bodinham C L，Smith L，Wright J W，et al.The effects of resistant starch on appetite，food intake and insulin［J］.The Proceedings of the Nutrition Society，2011，70:1.

［3］Hasjim J，Lee S，Hendrich S，et al.Characterization of a novel resistant-starch and its effects on postprandial plasma -glucose and insulin responses［J］.Cereal Chemistry，2010，87（4）:257-262.

［4］Al-Mana N，Robertson M D.The acute effects of resistant starch on appetite and satiety in overweight individuals［J］.The Proceedings of the Nutrition Society，2012，71:1.

［5］Zhou J，Martin R J，Tulley R T，et al.Failure to ferment dietary resistant starch in specific mouse models of obesity results in no body fat loss［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（19）:8844-8851.

［6］45.4.15.AOAC Official Method 2002.02，Resistant starch in starch and plant materials enzymatic digestion［S］.