灰兜巴多糖的抗氧化活性研究

黄莹偲，邓晓婷，李 冰，蔡春生，高永清，钟南京*

（1.广东药学院 食品科学学院，广东 中山 528458；2.华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州 510640）

0 前言

大量研究表明，临床许多疾病与机体的自由基、活性氧有关[1].活性氧主要包括羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-·)和有机或无机过氧化物(ROO·)等，有较强的生物活性，机体过量的自由基会引起蛋白质变性、多糖降解、DNA 链断裂等[2].灰兜巴（又名闭口袋）是一种生长在四川峨眉山老茶树上的菌科类植物，灰兜巴多糖被认为具有降低血糖的重要生理功能[3-5].作者旨在研究经过提取分离纯化的灰兜巴多糖组分的抗氧化活性和清除自由基的能力，为进一步探索灰兜巴多糖的抗氧化能力与降血糖作用之间的关系提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灰兜巴采购自四川省峨眉山；木瓜蛋白酶（美国Sigma 公司）；DEAE-Cellulose 52 (Whatman 产品) ；邻苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亚铁、水杨酸等均为分析纯.

HH-ZKS 型水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司；R-1001N 旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；HC-3618R 高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；LGJ-25 型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；BS-100A自动部分收集器：上海青浦沪西仪器厂；HL-2 恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司.

1.2 方法

1.2.1 灰兜巴多糖的提取分离和纯化[6-8]

采用水提醇沉法提取灰兜巴多糖，取适量灰兜巴加蒸馏水回流煎煮2 次，每次2 h，合并滤液离心，取上清液减压浓缩至原来体积的1/15～1/10，浓缩液加入无水乙醇使乙醇体积分数达到80%进行醇沉，离心后复溶沉淀物冷冻干燥得灰兜巴粗多糖；然后用木瓜蛋白酶-Sevag 法脱蛋白，配制10 mg/mL 粗多糖溶液，加入木瓜蛋白酶使其终浓度为1%，水浴3 h 酶解，经过Sevag 法反复处理3 次直至无明显沉淀，取上清液得到纯化的灰兜巴多糖.用苯酚-硫酸法测得多糖含量为28.02%.

采用DEAE-52 纤维素柱层析(1.5 cm×40 cm)进一步纯化，上样浓度为10 mg/mL，上样体积5 mL，依次用Tris-HCl 平衡缓冲液、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液进行洗脱，用恒流泵控制流速为1.0 mL/min，每10 min 收集一管.用苯酚-硫酸法跟踪检测各管多糖的含量，收集各洗脱组分，浓缩，透析(24 h)，冷冻干燥后得灰兜巴多糖各组分，并依次记为HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4.

1.2.2 灰兜巴多糖组分的体外抗氧化活性[9-11]

1.2.2.1 O2-·自由基清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法，取50 mmol/L（pH 8.2）Tris-HCl 缓冲液4.5 mL，置于25 ℃水浴中预热20 min，分别加入1 mL 不同浓度样品溶液（0.2～1.0 mg/mL）和0.4 mL 25 mmol/L 的邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，加入1.0 mL 8 mol/L HCl 终止反应，以Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2）为参比，在299 nm 处测吸光度，计算清除率.空白对照组以1 mL 蒸馏水代替样品溶液，阳性对照以相同浓度的抗坏血酸代替样品溶液.

1.2.2.2 DPPH 自由基清除能力的测定

分别取1 mL 不同浓度样品溶液（0.2～1.0 mg/mL）和2 mL DPPH-乙醇溶液加入试管中，加入1 mL 无水乙醇使反应总体积达到4 mL，摇匀后25 ℃水浴反应30 min，以无水乙醇为参比，在517 nm 波长下测吸光度.空白对照组以蒸馏水代替样品溶液，对照组以无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，阳性对照以相同浓度的抗坏血酸代替样品溶液.

1.2.2.3 ·OH 清除能力的测定

样品组试管中加入l mL 的0.15 mmol/L FeSO4，0.4 mL 的2 mmol/L 水杨酸，0.2 mL 不同浓度（0.2～1.0 mg/mL）的样品溶液，再加入1 mL 的6 mmol/L H2O2和0.4 mL 蒸馏水.空白组用蒸馏水代替样品溶液，对照组用蒸馏水代替水杨酸，以上3组试管放入水浴锅中37 ℃恒温1 h 后，取出冷却，以蒸馏水为参比，在510 nm 波长下测吸光度.

2 结果与讨论

2.1 灰兜巴多糖的DEAE-52 洗脱曲线

经过木瓜蛋白酶-Sevag 法脱蛋白的灰兜巴多糖，通过DEAE-52 纤维素离子交换柱进行层析，分别用缓冲液、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液进行洗脱后，根据峰值得到4 组多糖组分，洗脱曲线见图1.多糖组分HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4 的回收率分别为20.85%、29.63%、23.25%和12.49%，总的回收率为86.22%，HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4 经紫外光谱扫描，在260 nm 及280 nm 处均无紫外吸收，可认为它们是不含蛋白质和核酸等杂质的较纯的样品[12].

2.2 灰兜巴多糖及各组分DPPH 自由基清除能力

图2 是灰兜巴多糖及各组分的DPPH 自由基清除率，可以看出，在所研究的浓度范围之内，灰兜巴多糖及各组分的DPPH 自由基清除率均随着浓度的增加而增加，其中HDB-4 组分的清除能力最强.而其他3 个组分的DPPH 自由基清除率均低于灰兜巴粗多糖，其中HDB-2 组分的DPPH 自由基清除率最低.

图1 灰兜巴多糖的DEAE-52 洗脱曲线

图2 灰兜巴多糖及各组分的DPPH 自由基清除率

2.3 灰兜巴多糖及各组分·OH 自由基清除能力

图3 是灰兜巴多糖及各组分的·OH 自由基清除率，可以看出，在所研究的浓度范围之内，灰兜巴多糖及各组分的·OH 自由基清除率均随着浓度的增加而增加，其中HDB-3 和HDB-4 组分的清除能力较强.HDB-1 组分与灰兜巴粗多糖的·OH 自由基清除能力相当，其中HDB-2 组分的·OH 自由基清除率最低.

图3 灰兜巴多糖及各组分的·OH 自由基清除率

2.4 灰兜巴多糖及各组分超氧阴离子清除能力

图4 是灰兜巴多糖及各组分的超氧阴离子清除率，可以看出，在所研究的浓度范围之内，灰兜巴多糖及各组分的超氧阴离子清除率均随着浓度的增加而增加，其中HDB-3 组分的清除能力最强.灰兜巴粗多糖的超氧阴离子清除能力较低.

图4 灰兜巴多糖及各组分的超氧阴离子清除率

3 结论

经过木瓜蛋白酶-Sevag 法脱蛋白的灰兜巴多糖，通过DEAE-52 纤维素离子交换柱进行层析，得到了4 种较纯组分.各组分的活性研究表明，HDB-4 组分的DPPH 自由基清除能力最强，HDB-2 组分的清除率最低；HDB-3 和HDB-4 组分的羟基自由基清除能力较强，HDB-2 组分的清除率最低；HDB-3 组分的超氧阴离子清除能力最强，灰兜巴粗多糖的清除能力较低.各组分的抗氧化活性侧重点有所不同，其机理目前还不清楚，可能要结合各组分的分子结构等信息才能作出解释.

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