响应面分析法优化蛭弧菌生长条件

李春霞

(安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232001)

蛭弧菌(Bdellovibrio)是一类寄生于其它细菌并导致其裂解的寄生性细菌［1］。蛭弧菌具有类似噬菌体的功能，对自然环境中的细菌具有很强的裂解作用，其与宿主间并没有严格的特异性，有研究表明，蛭弧菌能裂解大多数科属的革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌［2］，能对导致人类食物中毒和渔业养殖病害的致病菌具有良好的裂解清除效果，且对动植物无毒副作用［3］。

响应面方法(Response Surface Methodology)是解决多变量问题的一种统计方法，其首先进行合理的试验设计，通过实验得到相应数据，运用多元二次回归方程拟合各因素与响应值的函数关系，通过对回归方程的显著分析来寻求最优的条件参数［4］。应用Design-Expert 软件系统对试验数据进行统计分析，拟合曲线，建立数学模型，检验模型的合适性，利用三维立体图形，观察响应曲面，寻求最佳组合条件［5］。

本文在研究影响蛭弧菌BD1 生长的pH、盐度(NaCl)、二价金属离子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸钠4个单因素实验的基础上，运用响应面分析法，以pH值、盐度、二价金属离子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸钠为响应因素，以菌体浓度的对数值为响应值，用Design-Expert 6.0 的中心组合实验设计(Central Composite Design，CCD)建立响应曲面模型，优化蛭弧菌BD1 的生长条件。

1 材料和方法

菌种:蛭弧菌BD1、宿主菌由本实验室分离保存

培养基:DNB 双层平板培养基等均按照参考文献［6］配制。

1.1 宿主菌培养

宿主菌接种于灭菌的2216E 液体培养基中，置于转速为200(r·min-1)，温度为28 ℃的恒温摇床中培养14～15 h，使其处于对数生长期。

1.2 蛭弧菌的培养

将悬浮好的蛭弧菌与宿主菌以体积比2∶5 均匀混合并静置30 min，取0.7 mL 混合液与3.5 mL 50 ℃的DNB 上层培养基均匀混合并倾注于DNB下层平板中。将DNB 双层平板倒置于温度为28℃的恒温培养箱中连续培养48～72 h。

1.3 实验设计

中心组合实验设计(Central Composite Design，CCD)是最常用的响应面分析法，适用于2～5 个因素的优化实验。采用该法能够在有限的试验次数下，对因子及其交互作用进行评价，而且还能对各因子进行优化，以获得影响过程的最佳条件。根据中心组合实验设计原理，本实验选取对蛭弧菌的生长繁殖能力具有明显影响的4 个因素，包括二价离子(Mg2+、Ca2+)(x1)、盐度(x2)、谷氨酸钠(x3)和pH(x4)，每个因素选取5 个水平，分别以-2，-1，0，1 和2 进行编码(见表1)，根据中心组合实验设计(见表2)进行相应的实验，研究蛭弧菌的最佳培养条件，为蛭弧菌的发酵培养提供理论基础。

表1 中心组合实验中的变量及其水平

表2 中心组合实验设计及其结果

1.4 培养方法

取30 个150 mL 的三角瓶，每瓶中精确地分装50 mL 新配置的DNB 液体培养基，根据中心组合实验设计(见表2)调节液体培养基的pH、盐度、谷氨酸钠和Ca2+、Mg2+浓度，高压灭菌后待用。向每瓶培养基中添加蛭弧菌和宿主菌，使其浓度分别达到2 ×102PFU/mL 和2 ×1010CFU/mL。在恒温摇床中(250 r·min-1)培养24 h，采用DNB 双层平板法检测瓶中蛭弧菌的浓度。中心组合实验需进行三次平行实验以减少实验误差，实验结果取平行实验的平均值。

1.5 验证实验

以响应面分析法得到的BD1 的最佳生长条件，做3 次平行实验，验证试验结果。通过实验结果与预测结果的相符性验证响应面分析方法的可靠性。

2 结果与分析

中心组合实验结果如表2所示，经Design Expert 6.0 软件用标准多项式回归法对实验数据分析拟合后得到如下二次回归方程

模型的方差分析结果如表3所示，在置信度水平α=0.01 时，该回归模型极显著，方程确定系数R2=0.9949，失拟项不显著，说明对数据进行很好的拟合，代表性较好，进而可用该方程代替真实试验点对结果进行分析和预测。同时，变差系数CV=4.75%相对较低，说明整个试验具有良好的精密度和可靠性。

模型回归方程系数的显著性检测结果如表4所示，pH 对蛭弧菌生长活性有极显著的影响(P＜0.0001)，谷氨酸钠浓度、盐度和二价金属离子浓度则对蛭弧菌的生长繁殖能力具有显著的影响(P＜0.05)。二次项(和)均极显著，且交互项(x2x3和x3x4)显著(P＜0.05)，说明各因素对响应值的影响并不仅仅是简单的线性关系，而是存在一定的交互作用，模型响应面如图1～图6所示。

表3 二次多项模型方差分析表

表4 二次多项模型中回归系数的估计值

图1 盐度与Ca2+、Mg2+间交互作用对蛭弧菌生长繁殖能力的影响曲面图和等高线图

图2 谷氨酸钠与Ca2+、Mg2+间交互作用对蛭弧菌生长繁殖能力的影响曲面图和等高线图

图3 pH 值与Ca2+、Mg2+浓度间交互作用对蛭弧菌生长繁殖能力的影响曲面图和等高线图

图4 谷氨酸钠与盐度间交互作用对蛭弧菌生长繁殖能力的影响曲面图和等高线图

图5 pH 与盐度间交互作用对蛭弧菌生长繁殖能力的影响曲面图和等高线图

图6 pH 与谷氨酸钠间交互作用对蛭弧菌生长繁殖能力的影响曲面图和等高线图

等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两个因素交互作用不显著，椭圆形表示两个因素交互作用显著［7］。从图1～图6 可以直观地看出，盐度和二价金属离子，谷氨酸钠和二价金属离子，谷氨酸钠与盐度交互作用不显著;pH 与盐度，pH 与谷氨酸钠，pH 与二价金属离子交互作用显著。

模型优化结果显示，当x1=-0.31，x2=-0.24，x3=-0.41，x4=0.38，即Ca2+、Mg2+浓度为6.38(mmol·L-1)，盐度为2.88%，谷氨酸钠浓度为4.18(mmol·L-1)，pH 为7.38 时，蛭弧菌的生长繁殖能力最强，此时模型预测蛭弧菌浓度对数值达到8.46。

为检验模型的可靠性，采用上述优化条件培养蛭弧菌，考虑到实际操作的便利，将优化条件修正为Ca2+、Mg2+浓度为6.4(mmol·L-1)，盐度为2.9%，谷氨酸钠浓度为4.2(mmol·L-1)，pH 为7.4，实际测得的蛭弧菌的浓度对数值为8.95，与理论预测值相对误差为5.8%，因此通过该模型优化得到的蛭弧菌BD1 的最佳培养条件准确可靠，具有一定的理论价值。

3 结论

本实验采用响应面分析方法，根据中心组合设计原理设计了四因素五水平实验，采用Design-Expert 软件处理实验数据，得到了菌体生长模型，以及模型最优时各因素的水平。实验结果显示:BD1 的最佳生长条件为:Ca2+、Mg2+浓度为6.4(mmol·L-1)，盐度为2.9%，谷氨酸钠浓度为4.2(mmol·L-1)，pH 为7.4。在该培养条件下，菌体生长模型达到显著水平，模型可以对蛭弧菌BD1在不同条件下的生长情况进行分析和预测，为蛭弧菌的培养和应用提供理论参考。

［1］STOLP H，PETZOLD H.Untersuchungen über einen obligat parasitischen Mikroorganismus mit lytischer Aktivität für Pseudomonas-Bakterien［J］.Journal of Phytopathology，1962，45(4):364-390.

［2］张昕，蔡俊鹏.噬菌体在水产养殖中的应用［J］.粮食与饲料工业，2004(6):38-39.

［3］LENZ R W，HESPELL R B.Attempts to grow bdellovibrios micurgically-injected into animal cells［J］.Archives of microbiology，1978，119(3):245-248.

［4］THOMPSON D.Response surface experimentation［J］.Journal of Food Processing and Preservation，1982，6(3):155-188.

［5］陶有俊，TAO D，赵跃民，等.采用Design-Expert 设计进行优化Falcon 分选试验［J］.中国矿业大学学报:自然科学版，2005(3):343-348.

［6］JURKEVITCH E，MINZ D，RAMATI B，et al.Prey range characterization，ribotyping，and diversity of soil and rhizosphere Bdellovibriospp.isolated on phytopathogenic bacteria［J］.Applied and environmental microbiology，2000，66(6):2 365-2 371.

［7］刘代新，宁喜斌，张继伦.响应面分析法优化副溶血性弧菌生长条件［J］.微生物学通报，2008，35(2):306-310.