雌性大鼠交配实验模型的建立*

张盼盼王 丽阿地力江·伊明**刘凤霞迪丽达尔·库德热提

1. 新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室（乌鲁木齐 830011）;

2. 新疆医科大学中医学院中西医临床2012-2班，3. 新疆医科大学基础医学院微生物学教研室

·论 著·

雌性大鼠交配实验模型的建立*

张盼盼1王 丽2阿地力江·伊明1**刘凤霞1迪丽达尔·库德热提3

1. 新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室（乌鲁木齐 830011）;

2. 新疆医科大学中医学院中西医临床2012-2班，3. 新疆医科大学基础医学院微生物学教研室

目的建立最佳雌性大鼠交配实验模型。方法正常雌性SD大鼠30只，随机分为自然组、黄体酮组和去势+药物组，每组10只。自然组大鼠不给于任何处理；黄体酮组于交配前4h仅注射黄体酮500μg/只；去势+药物组统一行双侧卵巢切除术，于交配实验前48h和4h分别皮下注射苯甲酸雌二醇20μg/只和黄体酮500μg/只。各组于交配前进行阴道涂片，并正常雄鼠进行交配实验，检测其交配成功率。结果自然组1 只大鼠发情，交配成功率10%；黄体酮组2只大鼠发情，交配成功率20%；去势+药物组阴道涂片显示全部处于发情期，交配成功率为100%。结论 雄鼠的性行为与雌鼠是否发情密切相关，在性行为学检测中，经雌孕激素处理的去势雌鼠为最佳交配实验模型。

卵巢切除术; 大鼠; 交配; 模型

近年来，随着生活节奏加快，压力增大，男性勃起功能障碍（Erectile dysfunction, ED）的发病率呈逐年上升趋势。有资料显示，在世界范围内，1995年ED患者达1.52亿，在40 ～70岁的男性中，约有52%的男性有不同程度的ED，预计到2025年将会上升至3.22亿人[1]。因此，ED的研究成为社会的需要，而雄性动物的性行为学检测是ED研究的重要组成部分，规范的性行为学实验则尤为重要。本文对用于交配实验的几种可能的雌鼠模型进行比较研究，以确立最佳模型，为性行为学实验提供良好的工具。

材料与方法

一、实验动物

2月龄清洁级雌性SD大鼠30只，雄性SD大鼠10只，平均体质量（200±30）g，新疆医科大学动物实验中心提供。大鼠自由饮食水，给予规律光照（12/12h），室内相对湿度40%～60%，室温（22±2）℃。

二、主要试剂、药物及设备器械

苯甲酸雌二醇注射液2mg/mL（宁波三生药业有限公司），黄体酮注射液20mg/mL（ 浙江仙琚制药股份有限公司），瑞氏-姬姆萨染液（珠海贝索生物技术有限公司），显微成相系统（德国leica公司），常规手术器械一套。

三、实验方法

（一）实验动物分组

30只雌性大鼠随机分为自然组、黄体酮组和去势+药物组，每组10只。

（二）去势组卵巢切除方法

手术器械常规消毒，大鼠以1%戊巴比妥钠腹腔麻醉（35mg/kg）。仰卧位，剪除背部手术区毛发，常规消毒，以最后一肋和两大腿根部连线中点为中心切一约1cm的纵行切口，暴露肌肉层，剪一约0.6cm的纵行切口，在切口深面可看到白色脂肪团，用组织镊将脂肪团拖出，可看到在脂肪团的中央有一灰红色、直径约0.5cm、表面有不规则结节的卵巢，结扎并切除卵巢后缝合。用同样的方法切除右侧卵巢（见图1）。术后切口碘伏消毒，肌注青霉素20万U/ kg•d-1，连续3d，休息2周，注意保温。

图1 卵巢去势过程

（三）激素药物注射

黄体酮组于交配前4h仅注射黄体酮（progesterone）500μg/ 只；去势+药物组于交配实验前48h和4h皮下注射苯甲酸雌二醇（estradiol benzoate） 20μg/只和黄体酮500μg/只；自然组不给予任何处理。

（四）阴道涂片的制备

3组大鼠于交配实验前进行阴道涂片。将蘸有生理盐水的自制棉签插入雌鼠阴道内旋转一圈，抽出棉签并在载玻片上滚一圈，涂片用95%酒精固定，待酒精干燥后，采用瑞氏-姬姆萨染液进行染色并镜检。

（五）雄鼠筛选实验

在交配实验正式开始前1周，对雄鼠进行筛选，只将有交配能力的雄鼠纳入实验。

（六）交配实验

实验时间安排在晚上19：00～20：00，保持室内安静，调暗光线至刚好可以看清为止，将雄鼠放入观察笼，适应10min后，将雌鼠轻轻放入笼中，雌雄比例2:1，观察并记录其在30min内的交配行为。

（七）统计学处理

SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、雌鼠去势结果

雌鼠去势后均在1h内苏醒，伤口无感染、渗血情况。1周后进行阴道涂片，连续5d，无动情周期变化。

二、阴道涂片结果

去势+药物组注射上述激素药物后，交配前阴道涂片显示均处于发情期，黄体酮组注射黄体酮后仅有2只大鼠处于发情期，自然组仅1只大鼠处于发情期，见表1。处于发情前期大鼠的阴道涂片中，以有核的圆形上皮细胞为主；处于发情期大鼠的阴道涂片中，上皮细胞成熟，脱落，变成角质细胞，主要为无核多边形细胞；发情后期的涂片中则白细胞出现，到了发情间期白细胞大量出现，还伴有少量的上皮细胞和角化细胞。各发情周期阴道涂片，见图2。

表1 3组阴道涂片大鼠发情结果比较（只）

三、交配实验结果

处于发情期的雌鼠均成功交配，其余雌鼠则拒绝交配（见表2）。雄鼠交配过程包括嗅舔、爬背、插入、射精一系列行为（见图3）。若雌鼠发情状态良好，当雄鼠靠近会出现“角弓反张”动作，即雌鼠脊柱向下弯成弓形，颈部昂起，臀部翘起，同时双耳高频震颤，并伴有迅速而短暂的跳跃动作。当雌鼠处于非发情期时，会拒绝雄鼠的一系列性行为，例如当雄鼠嗅舔雌鼠会阴区时，雌鼠会用后腿蹬踹雄鼠；当雄鼠爬背时，雌鼠会翻过身来反抗，甚至撕咬。若雄鼠足够强壮，也可发生插入，但交配成功率较低。

表2 交配结果

图2 大鼠发情周期阴道涂片（20×10）倍

A: 嗅舔; B: 爬背; C: 插入; D: 射精

讨 论

雌鼠只在发情期的数小时内允许雄鼠交配。雌鼠的发情不受季节温度的影响，具有多发性、周期性的变化规律。大鼠性周期为4～5d，在此周期内，生殖系统发生一系列组织学的变化，可作阴道涂片检查[2]。目前，国内外研究雄性性行为的方法各异，国内有学者对雌鼠每天进行阴道涂片，检查处于动情期的雌鼠用来和雄鼠交配，以此来对雄性性行为学进行相关研究[3]，但该方法很难保证多只雌鼠同时处于发情状态，并容易造成雌鼠阴道感染，且涂片过程对雌鼠也是一种外源性刺激，易干扰其生理周期。另有学者[4]直接将雄鼠与未交配过的成年雌性大鼠进行合笼，第一周仅有1/3～1/2完成交配。我们通过比较自然组、黄体酮组和去势+药物组大鼠的交配成功率，最终确定经雌孕激素处理的去势雌鼠与雄鼠进行交配，成功率最高，此法可在同一时间内获得多只发情状态良好的雌鼠。由于雄性的性行为主要由雌鼠的引诱而激发的，所以，本模型不仅可以用于研究各类因素引法的雄性大鼠性行为的改变、性功能障碍以及药效评价，还可利用该模型研究性的激发与调控机制等。

在雌鼠发情前期，雌激素分泌开始升高，但血液中雌激素含量还较低，所以阴道上皮细胞增殖速度缓慢，脱落到阴道中的细胞较小，常呈椭圆形或近圆形的有核细胞[5]。发情期，血液中的雌激素含量达到高峰， 雌激素可刺激阴道上皮增厚，上皮细胞迅速发育，体积变得大而扁平，常呈大方块、多边形，有钝角，易于脱落[6]。在雌激素的作用下，上皮细胞合成和聚集大量的糖原，随表层细胞的脱落，糖原在阴道杆菌作用下分解成乳酸，使阴道保持酸性，可防止病菌的入侵[5]。发情间期，雌激素含量很低，孕酮含量较高，角质化上皮细胞很少，上皮变薄，白细胞浸润，防止由于糖原减少而引起的微生物繁殖感染。这时阴道涂片就以白细胞为主。发情后期仅是发情期向发情间期的过渡，所以3 种细胞均有[7]。

本实验中，经雌孕激素处理的去势大鼠阴道涂片均显示为发情期，在稍后的交配实验中均出现典型的发情现象，如角弓反张、双耳高频震颤等，且交配成功率为100%，说明此模型为性行为学实验中的首选模型；而黄体酮组大鼠在卵巢存在的情况下，外源性给予孕激素，结果显示并不能促使其都处于发情状态，原因可能与血液中雌激素的含量相关，说明孕激素必须在雌激素的作用下才能发挥催情效应；自然组大鼠不做任何处理直接进行阴道涂片并交配，结果显示仅一只大鼠处于发情期且交配成功，进一步证实了雄鼠的交配成功率与雌鼠发情状态有着直接的必然联系。

1 Ayta IA, Mekinlay JB, Krane RJ. The likely worldwide increase in erectile dysfunction between 1995 and 2025 and some possible policy consequences.BJU Int1999; 84(1): 50-56

2 施新猷. 现代医学实验动物学. 北京: 人民军医出版, 1999: 331

3 吴水生, 张文光, 郑良朴, 等. 交配频率对雄性大鼠血清一氧化氮水平的影响. 中国行为医学科学 2005, 14(5): 400

4 周激文, 李文琦, 潘汝能, 等. TH5对雄性大鼠性行为与血清性激素水平影响的研究. 标记免疫分析与临床2000; 7(2): 81-83

5 南京医学院, 浙江医科大学, 上海第二医科大学, 组织胚胎学(第3版). 江苏: 科学技术出版社, 1990 : 176-177

6 Chateau D, Geiger J M, Samama B,et al.Vaginal keratinization during the estrous cycle in rats: a model for evaluating retinoid activity.Skin Pharmacol1996; 9(1): 9-16

7 李雨珊, 李斌, 马立会, 等. 发情雌鼠鉴定对交配成功率的影响. 中国现代医药杂志 2011; 13(11): 5-7

（2014-04-28收稿）

The establishment of female rats mating model*

Zhang Panpan1, Wang Li2, Adilijiang Yiming1**, Liu Fengxia1, Dilidaer Kudereti3
1. Department of Human Anatomy, Collge of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China;
2. Traditional Chinese and Clinical Medicine 2012-2; College of Traditional Chinese MedicineXinjiang Medical University; 3. Department of Microbiology; Collge of Basic Medicine; Xinjiang Medical University

Adilijiang Yiming, E-mail: adljym@163.com

ObjectiveTo establish the best female rats mating model.MethodsTotal of 30 normal female SD rats were randomly divided into three groups including the natural group(10 rats), the progesterone group(10 rats) and the castration group(rats). Rats in the progesterone group were injected with 500 ug progesterone at 4h before the mating test. Rats in the castration group whose underwent bilateral ovariectomized were injected with 20μg estradiol benzoate and 500ug progesterone at 48h and 4h respectively before mating. Rats in the natural group were as the control. Vaginal smear was performed before mating test, and then the mating test was done.ResultsOnly 1 rat was in estrus in the natural group, successful mating rate of this group was 10%; Two rats of progesterone group were in estrus, and the successful rate was 20%; rats of castration group were all in estrus, and the successful rate was 100%.ConclusionMale sexual behavior was closely related to female estrus. Hormone-treated females castration rats were the best animal mating models.

ovariectomy; rats; copulation; models

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.002

R-332

资助: 国家自然科学基金（81160470，81260581）; 新疆医科大学校内支撑学科项目（XYDXK50780307)
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, E-mail: adljym@163.com