右归胶囊对肾阳虚不育模型大鼠生殖功能影响的实验研究

王旭昀 李海松 张宏 党进

右归丸是张景岳根据《难经》“阴中求阳”的理论所创，具有温补肾阳，填精补血的作用，右归胶囊是在右归丸基础上开发出的一种新剂型，药物成分、适应症和右归丸完全相同，对肾阳不足、肾精亏虚症所导致的不育有较好的临床疗效。目前尚未有实验研究来证实右归胶囊对肾阳虚男性不育症的治疗作用。本实验从大鼠生殖性腺的重量及组织形态学变化两方面观察了右归胶囊对腺嘌呤致肾阳虚不育模型大鼠生殖功能的影响，探讨其治疗男性不育症的机制所在，为临床应用提供了实验依据，现汇报如下。

1 实验材料

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠45 只，育龄3 个月左右，清洁级，体重(300±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，公司许可证号:SCXK(京)2006-0009，批号:20090316。大鼠饲养及实验均在清洁级动物实验室北京中医药大学中医药科技发展中心实验动物中心进行，合格证号:SYXK(京)2006-0012。清洁饲料由北京科奥协力饲料有限公司供给。

1.2 实验试剂与药品

右归胶囊:由江西银涛药业有限公司提供(国药准字Z20030134，生产批号:1002005);腺嘌呤(Adenine):由国药集团化学试剂公司生产(生产批号20090107);上述药品临用前混悬于0.5%的羧甲基纤维素(caboxy methyl cellulose，CMC)中灌胃;羧甲基纤维素钠:由北京化学试剂有限责任公司生产(生产批号:3405005)氯化钾、果糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、Bouins 液、无水乙醚、无水乙醇、磷酸二氢钠、氯化钠等，均由国药集团化学试剂公司生产。

1.3 实验仪器

DL-8R 冷冻离心机:深圳天南海北实业有限公司产品;细胞计数器:上海医用光学仪器厂;Olympus BX60 荧光显微镜:日本产。

2 实验方法

2.1 实验动物的分组及给药方法

购入3 个月龄左右SD 雄性大鼠45 只，将大鼠置于清洁级动物室中，动物室室温28℃、湿度65%，自由进食饮水适应1 周后，按照随机数字表法将其分为正常组、模型组、右归组，每组15 只。正常组常规喂养，0.5%羧甲基纤维素钠(10 ml/kg)灌胃，4小时后给予10 ml/kg 的蒸馏水灌胃;模型组常规喂养，0.5%羧甲基纤维素钠(10 ml/kg)灌胃，4 小时后0.5%羧甲基纤维素钠配制后的腺嘌呤(10 ml/kg)灌胃(每ml 含腺嘌呤25 mg);右归组常规喂养，0.5%羧甲基纤维素钠配置的“右归胶囊”(10 ml/kg)、每ml 含右归胶囊154.3 mg(1543 mg/kg)灌胃(人体用量的20 倍);4 小时后用0.5%羧甲基纤维素钠配制后的腺嘌呤(10 ml/kg)灌胃(每ml 含腺嘌呤25 mg)。以上操作每日1 次，共30 天。实验期间每5天称体重1 次，调整给药量。给药量按人和动物体表面积计算公式计算。

实验及取材过程中，正常组大鼠死亡4 只，模型组大鼠死亡5 只，右归组大鼠死亡4 只，故三组最终有效例数分别是正常组11 只、模型组10 只、右归组11 只。

2.2 实验动物的处理

给药后第30 天将每组大鼠于末次给药1 小时后在安静状态下用10%水合氯醛麻醉;取血后立即取出双侧睾丸、附睾、前列腺+精囊腺电子天平称重;右侧睾丸用睾丸用Bouins 液(苦味酸饱和液75 ml、甲醛25 ml、冰醋酸5 ml 配制)固定，24 小时后脱水，包埋，制块，切片5 μm，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察各组大鼠睾丸曲细精管形态及精子发生状态。

2.3 测定指标和方法

2.3.1 组织重量测定 于末次给药1 小时后处死大鼠，立即以YB 型电子天平测量大鼠睾丸、附睾、精囊腺的重量。

2.3.2 组织形态学观察 取出已固定的睾丸解剖标本、睾丸矢状断面标本，取组织缓冲液中后固定，按病理学常规方法脱水、透明、包埋、切片(5 μm厚)，苏木素-伊红(HE)染色;光镜下观察各实验组大鼠睾丸组织结构有无病变，同时观察各组大鼠睾丸生精小管结构、排列密度、曲细精管内各级精原细胞数量、生精细胞排列层次及精子数量等组织结构变化。

2.4 统计学处理

数据应用SAS 8.2 统计软件分析。计量资料数据采用(±s)表示，方差齐性检验采用Levene 检验，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两均数间比较采用LSD-t 法，P＜0.05 提示差异有统计学意义。为保证检测指标的客观真实性，统计数据时剔除不符合正态分布原则的界外值。

3 结果

3.1 右归胶囊对肾阳虚不育模型大鼠生殖器官重量的影响

以腺嘌呤混悬液为灌胃药物，诱发肾阳虚不育模型大鼠，经右归胶囊灌胃治疗后，各组大鼠生殖器官重量存在着显著的差异。右归组大鼠左侧睾丸、右侧睾丸，左侧附睾、右侧附睾，前列腺+精囊重量均低于正常组大鼠但高于模型组大鼠，差异有统计学意义。五组数据组间比较均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两均数间比较均采用LSD-t 法，结果见表1。

3.2 右归胶囊对肾阳虚不育模型大鼠睾丸组织形态学的影响

3.2.1 肉眼观察 正常组大鼠睾丸体积基本正常，表面光滑，可见血管走行;模型组大鼠睾丸体积明显缩小;大部分右归组大鼠睾丸体积恢复近至正常。

3.2.2 光镜观察睾丸组织病理学变化 正常组大鼠睾丸曲细精管排列规则整齐，各级生精细胞发育良好，数量正常，层次分明，管腔内可见成熟精子，管壁边界整齐，基膜薄，睾丸间质细胞数目及形态正常，未见变性及坏死等病变(图1A、B);模型组大鼠睾丸曲细精管明显萎缩，各级生精细胞明显减少，部分脱落，支持细胞相对增多，管腔内精子明显减少(图1C、D)，曲细精管之间的结缔组织增多，间质细胞数目亦明显减少;右归组大鼠睾丸曲细精管萎缩明显减轻，各级生精细胞、精子数量及间质细胞数量较模型组增多(图1E、F)。由上可知，右归组大鼠睾丸曲细精管萎缩明显减轻，各级生精细胞、精子数量及间质细胞数量较模型组增多，表明右归胶囊对腺嘌呤致肾阳虚不育有较好的治疗作用。

4 讨论

4.1 实验动物的选择及模型制备评价

SD 大鼠体型较大，适宜做生殖器官的损伤修复等实验，常用于计划生育方面的研究。本实验为男性不育症研究，动物模型为生精细胞损伤，故在本实验中选择3月龄SD 雄性大鼠为受试动物。腺嘌呤诱发肾阳虚不育模型大鼠，一方面可直接损伤睾丸使精子数目减少，另外一方面可直接或间接地引起大鼠其它生殖腺组织损伤、功能损害，从而导致精液质量变差，已有相关文献指出腺嘌呤灌胃或者喂养动物能够诱导理想的肾阳虚睾丸功能损害模型［1］。此外，腺嘌呤诱导的肾阳虚不育模型大鼠血清睾酮水平偏低，雌二醇偏高［2］，因此从形态学表现及反映生殖系统改变的各项指标上来看，腺嘌呤诱导的肾阳虚不育模型最优。

本实验采用腺嘌呤灌胃复制肾阳虚不育模型大鼠较为成功，具体表现如下:(1)睾丸病理切片发现模型组大鼠睾丸曲细精管明显萎缩，各级生精细胞明显减少，部分脱落，支持细胞相对增多，管腔内精子明显减少，曲细精管之间的结缔组织增多，间质细胞数目亦明显减少，表明不育模型的成功。(2)模型组大鼠大部分于给药第十天出现拥挤在一起，萎靡不振、畏寒怕冷、反应迟钝等现象;后逐渐出现皮毛无光泽、饮食减少、腹部皮毛、尾巴潮湿、耳廓苍白、眯眼、眼睑周围浮肿、竖毛、多尿等类似肾阳虚的症状，且症状随给药日数增加而加剧，表明肾阳虚模型的成功。

表1 各组大鼠睾丸、附睾、精囊腺+前列腺重量的比较(±s)

表1 各组大鼠睾丸、附睾、精囊腺+前列腺重量的比较(±s)

注:与正常组比较aP＜0.05，bP＜0.01;与模型组比较cP＜0.01

组别例数 右侧睾丸重量(g) 左侧睾丸重量(g) 右侧附睾重量(g) 左侧附睾重量(g) 精囊+前列腺重量(g)正常组 11 1.57±0.19 1.55±0.23 0.53±0.06 0.54±0.09 2.03±0.49模型组 10 0.90±0.27b 0.91±0.28b 0.31±0.11b 0.29±0.09b 0.46±0.13b右归组 11 1.30±0.25ac 1.30±0.24ac 0.42±0.08bc 0.43±0.09bc 0.95±0.37 bc

图1 各组给药后第30 天大鼠睾丸组织HE 染色

4.2 右归胶囊对肾阳虚不育模型大鼠生殖功能的影响及机制探讨

本实验发现右归组大鼠睾丸、附睾、精囊腺+前列腺重量之和较模型组有明显增加，差异有统计学意义，这一点与文献报道一致［3］。睾丸、附睾、精囊腺及前列腺的发育有赖于雄激素的支持，提示右归胶囊有雄激素样作用。

模型组大鼠睾丸病理切片示曲细精管明显萎缩，各级生精细胞明显减少、部分脱落，支持细胞相对增多，管腔内精子明显减少，曲细精管之间的结缔组织增多，间质细胞数目亦明显减少;右归组大鼠睾丸曲细精管萎缩明显减轻，各级生精细胞、精子数量及间质细胞数量较模型组增多。表明右归胶囊能有效防止腺嘌呤对曲细精管及各级生精细胞的损伤，与文献报道一致［4-5］。这可能是右归胶囊治疗肾阳虚男子不育症的一个机理所在，而右归胶囊对间质细胞的保护作用可能是其雄激素样作用的机制所在。

总之，右归胶囊可明显提高大鼠睾丸、附睾、精囊腺、前列腺重量，特别是对附睾的影响，为精子的发生、成熟提供了较好的环境，是其治疗男性不育症的一个机制所在。右归胶囊直接作用于睾丸曲细精管、保护生精细胞，促进精子的发生和发育，亦是其治疗男性不育症的一个重要机制。

［1］傅晓晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作肾阳虚型慢性肾功能衰竭模型大鼠的生化研究［J］.福建中医学院学报，2003，13(1):22-24.

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