不同浓度艾烟干预12周对大鼠肺与骨骼肌的影响

黄剑 韩丽 林岷瑜 白桦 杨佳 王磊 崔莹雪 刘钧天 黄畅 赵百孝

《灵枢·官能篇》载有“针所不为，灸之所宜”，艾灸疗法具有数千年的历史，是中国传统医学的主流疗法之一，具有广泛的适应证和确切的治疗效果。但艾灸过程中产生一定的烟雾，针灸从业人员和患者常暴露于艾燃烧产生的烟雾中，时有眼睛流泪、咽喉不适等反应［1］，大量长期吸入艾烟可能对机体有害［2］，严重影响艾灸的应用与推广。研究显示，艾灸导致诊室内可吸入颗粒物(particles with an aerodynamic diameter of less than 10 μm，PM10)浓度升高，超出国家空气质量标准［3］，大气可吸入颗粒物的增加可导致慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)住院率和死亡率增加、肺功能下降等［4-5］。

香烟燃烧亦产生一定烟雾，主动吸烟与被动吸烟严重危害人体健康。大量流行病学调查表明，吸烟是COPD 最重要的发病因素，香烟中的毒性成分和外源性活性氧(reactive oxygen species，ROS)可直接诱导肺内发生炎症反应和细胞凋亡。细胞凋亡、氧化损伤和炎症反应三者互为因果，形成闭环链式反应，导致COPD 的发生［6］，并伴随骨骼肌炎症反应和营养不良。

本实验通过观察不同浓度艾烟干预大鼠12 周后对其血清瘦素、膈肌和趾长伸肌腱肿瘤坏死因子-ɑ(tumor necrosis factor，TNF-ɑ))、白介素-8(interleukin-8，IL-8)的变化并观察肺、骨骼肌病理改变来探讨艾烟对大鼠肺、骨骼肌的影响，以期为艾烟的安全性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

3年陈艾条(规格18 mm ×200 mm ×10 支;南阳汉医有限责任公司生产)，全自动电子分析天平(河南爱博特科技发展有限公司生产)，动式染毒柜(产品型号HOPE-MED8050，天津开发区合普工贸有限公司生产)，JY99-ⅢB 型超声器(宁波新芝科器研究所)，5415R 高速离心机(德国Eppendorf 公司)，Lambdal P40 紫外可见分光光度仪(美国PE 公司)，Multiskan 3 酶标(芬兰Thermo);光学显微镜(Olympus BH，单位编号NO.060107)。

1.2 实验动物与分组

本实验选择7 周龄雌雄Wistar 大鼠40 只，体重(60±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号:［SCXK(京)2012-0001］。所有动物均用标准饲料喂养，自由进水;饲养环境温度18～22 ℃，采用人工控制照明，保持12 小时光照(8∶00～20∶00)和黑暗(20∶00～次日8∶00)交替循环，相对湿度为50～60%。适应性饲养1 周，按照随机数字表法将40 只大鼠随机分为四组，每组10 只，雌雄各半。空白对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组分别暴露于0 mg/m3、2.5～3.5 mg/m3、8.0～10.0 mg/m3、27.0～29.0 mg/m3艾烟浓度的动态染毒柜中(折算为0%、0.4%、2%、15%的透光率)，每组在不同浓度组艾烟中暴露12 周，每天200 分钟，5 次/周，12 周末取材。

1.3 用动式染毒柜进行艾烟干预

该实验选用动式染毒柜可精确控制艾烟浓度并维持染毒环境氧气、温度、湿度、压强的恒定。艾烟浓度用透光率度量，浓度越低，透光率越高。打开染毒柜电源，设置动式染毒柜各项参数:氧气为26%、湿度45～63%、温度20～22 ℃、压强－70 kp、时间200 分钟，观察染毒柜屏幕显示，待染毒柜内艾烟浓度分别达到低、中、高相应浓度，打开舱门，迅速放入动物，待仪器显示干预时间已到，取出动物;空白对照组放置于染毒柜中，设置动式染毒柜各项参数同前，不进行任何干预。

1.4 取材

1.4.1 血清 沿腹白线剪开腹腔，移开肠胃，分离脂肪，找到脊柱，再沿脊柱找到腹主动脉，将注射器针头从远心端向近心端刺入动脉，抽血5 ml。静置2小时后，3000 rpm 离心10 分钟，取上层血清，－20 ℃存放，备检。

1.4.2 膈肌和趾长伸肌腱 沿腹部向上延长正中线切口至大鼠颈部，在膈肌以上横着剪开胸壁，打开胸腔，灭菌组织剪小心分离大鼠膈肌，放入事先用焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)处理过的冻存管中，液氮冻存。在大鼠右后肢剪开皮肤，灭菌组织剪分离趾长伸肌腱，放入事先用DEPC处理过的冻存管中，液氮冻存。

1.5 病理学检查

肺、膈肌和趾长伸肌腱用生理盐水冲洗干净后经10%中性甲醛固定，酒精系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，HE 染色，光学显微镜下观察。

1.6 检测指标

瘦素、膈肌和趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量的测定采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)原理定量测定血清瘦素、膈肌和趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学处理。指标均采用均值±标准差(±s)表示，若各组数据服从正态分布，组间比较采用单因素方差分析;若不服从正态分布，采用非参数检验，结果以中位数和四分位数间距［M(Q3－Q1)］表示。P＜0.05 为有差异，具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体重及外观行为变化

艾烟染毒大鼠12 周期间，未出现明显中毒死亡，各组大鼠被毛外观体征、行为活动、精神状态、粪便、食欲等未见明显毒性改变，未见呕吐、流涎等耳鼻眼口等异常分泌物。各组雌性大鼠体重均服从正态分布，采用单因素方差分析;而各组雄性大鼠体重不服从正态分布，采用非参数检验。统计结果表明，可以认为第12 周雌雄大鼠体重未见明显差异(P＞0.05)，见表1。

表1 第12 周大鼠体重比较(g)

2.2 膈肌、趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量比较

各组雌雄大鼠膈肌、趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量均服从正态分布，采用单因素方差分析。统计结果表明，不能认为空白对照组，低、中、高浓度艾烟各组大鼠膈肌、趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量不等(P＞0.05)，见表2。

表2 不同浓度艾烟对大鼠膈肌、趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 的影响(pg/mg，±s)

表2 不同浓度艾烟对大鼠膈肌、趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 的影响(pg/mg，±s)

注:各组总体均数比较，1aP=0.951，2aP=0.436，1bP=0.706，2bP=0.900，1cP=0.574，2cP=0.528，1dP=0.957，2dP=0.940，P＞0.05

性别与组别 n 膈肌TNF-ɑ 含量a 膈肌IL-8 含量b 趾长伸肌腱TNF-ɑ 含量c 趾长伸肌腱IL-8 含量d雌性1空白对照组 5 22.86±5.11 94.76±29.15 24.79±3.45 74.87±24.53低浓度组 5 22.52±4.69 94.26±21.24 18.82±9.21 80.56±12.74中浓度组 5 22.01±7.66 92.06±23.08 21.90±5.48 82.28±29.32高浓度组 5 20.72±6.97 79.63±17.87 21.89±6.82 80.53±20.01雄性2空白对照组 5 23.25±7.51 85.58±18.54 24.39±3.55 90.99±21.66低浓度组 5 21.71±7.46 85.06±15.91 22.55±6.55 85.52±33.00中浓度组 5 18.86±5.91 77.87±17.91 22.87±5.66 81.50±26.45高浓度组 5 17.02±4.03 84.25±20.46 19.55±4.36 88.14±1 4.81

2.3 血清瘦素含量比较

各组雌雄大鼠血清瘦素含量均服从正态分布，采用单因素方差分析。统计结果表明，不能认为空白对照组，低、中、高浓度艾烟各组大鼠血清瘦素含量不等(P＞0.05)，见表3。

表3 不同浓度艾烟对大鼠血清瘦素的影响(ng/ml，±s)

表3 不同浓度艾烟对大鼠血清瘦素的影响(ng/ml，±s)

注:雌、雄大鼠各组总体均数比较，P＞0.05;雌性大鼠各组间比较，P=0.735，P＞0.05;雄性大鼠各组间比较，P=0.989，P＞0.05

性别与组别 n 血清瘦素含量雌性空白对照组 5 22.38±1.27低浓度组 5 22.67±4.99中浓度组 5 21.72±5.16高浓度组 5 20.16±2.35雄性空白对照组 5 21.35±2.48低浓度组 5 20.70±4.64中浓度组 5 20.81±4.05高浓度组21.41±4.74 5

2.4 大鼠肺、膈肌、趾长伸肌腱病理组织观察

空白对照、低、中、高浓度艾烟各组大鼠肺、膈肌、趾长伸肌腱病理组织均无显著差异。肺组织染色均匀，组织结构清楚，无变性、无坏死，无纤维组织增生;膈肌、趾长伸肌腱为一片状附有筋膜的横纹肌，膈肌细胞排列整齐，无肿胀、溶解、空泡样改变，肌间隙无炎症细胞浸润;趾长伸肌腱肌细胞排列整齐，未见变性、坏死，萎缩、溶解等变化，肌间隙无炎症细胞浸润，表明艾烟暴露未导致肺、膈肌、趾长伸肌腱病理性改变，见图1～3。

图1 大鼠肺组织病理学检查(HE 染色，×400)

图2 大鼠膈肌病理学检查(HE 染色，×400)

图3 大鼠趾长伸肌腱病理学检查(HE 染色，×400)

3 讨论

前期研究显示，艾烟与香烟烟雾的化学成分不同［7-9］，对细胞、各组织器官的影响亦有差异［10-15］。大量流行病学调查表明，香烟造成COPD 并伴随骨骼肌炎症反应和营养不良，采用被动吸烟建立的COPD 动物模型也是目前所有模型中最接近人类的COPD，但未见艾烟造成COPD 并影响骨骼肌的报道。

本实验率先研究艾烟对大鼠骨骼肌的影响，研究结果表明，亚急性毒理实验中艾烟对大鼠肺、膈肌和趾长伸肌腱的病理组织切片、TNF-ɑ、IL-8 以及血清瘦素无明显的影响。因此，艾烟对大鼠肺和骨骼肌无明显毒性作用。

在亚急性毒理实验过程中，观察雌雄大鼠的外观体征和行为活动，粪便性状等均未见明显毒性改变，艾烟干预组雄性大鼠体重于第5 周较空白对照组降低，但第12 周体重恢复提示应激反应，所以雌雄大鼠体重均未见明显影响。此外，本实验选取大鼠体重为指标，观察艾烟对大鼠全身骨骼肌的变化，能够更加客观、整体地反映艾烟对大鼠骨骼肌的影响。

COPD 是一种具有气流受限为特征的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，这种改变与气道炎症密切相关，从而导致气道壁的损害。肺弹性回缩力下降，呼出气流受限，呼吸肌负担加重，并伴随全身性炎症反应的表现［16］。其中骨骼肌是COPD 系统性损伤最主要的受累器官，表现为肌肉功能障碍、萎缩及肌肉中无脂肪组织的减少［17］。严重的COPD 患者其肌肉萎缩程度和疾病程度成正相关，是COPD 死亡的独立危险因素［18-19］。本实验选择膈肌和趾长伸肌腱作为呼吸肌和外周肌的代表，因为膈肌是最主要的呼吸肌，在呼吸过程中所起的作用约占全部呼吸肌的60～80%［20］，而趾长伸肌腱是大鼠肢体远心端的肌肉，在大鼠活动中活动频率很高，排除了废用性萎缩的可能，两种肌肉的选择具有良好的代表性。

香烟烟雾导致肺部启动一系列的炎症反应，使组织中TNF-α、IL-8 等炎症介质的释放增加，这些炎症介质又进一步活化了炎症细胞［21-22］。瘦素和COPD 有着密切的关系，它与COPD 患者的营养不良和炎症状态有关。瘦素除了参与COPD 的全身性炎症反应外，还参与了气道局部炎症反应并且影响COPD 的发生、发展和预后，是病情评价的重要指标。进一步的相关分析表明，COPD 患者急性加重期瘦素与TNF-α 的水平有明显正相关性［23］。本实验雌雄大鼠膈肌TNF-ɑ 的P 值有波动，可能与样本量不足有关，有待增加大鼠样本量以做进一步研究。

4 结论

本次亚急性毒理实验率先探讨艾烟是否会造成COPD 导致骨骼肌炎症反应和营养不良，发现低、中、高浓度艾烟干预雌雄大鼠后，血清瘦素、膈肌和趾长伸肌腱TNF-ɑ、IL-8 含量与空白对照组无显著差异，各组肺、膈肌和趾长伸肌腱病理未见显著改变，表明艾烟未对大鼠骨骼肌造成明显炎症和营养不良反应，提示艾烟对大鼠骨骼肌无明显毒性作用。本研究提出新的艾烟毒理实验和安全性分析的方法、指标，进一步说明艾烟与香烟烟雾的差异性，为艾烟安全性评价提供了实验数据，有效加快灸法的科学化、现代化和国际化进程。

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