齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物酸水解工艺及水解后苷元含量测定*

李古月，刘佳鑫，才 谦

（1.中国医科大学附属第一医院，沈阳 110000；2.中国医科大学药学院，沈阳 110000；3.辽宁中医药大学药学院，大连 116600）

齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物酸水解工艺及水解后苷元含量测定*

李古月1，2，刘佳鑫1，2，才 谦3

（1.中国医科大学附属第一医院，沈阳 110000；2.中国医科大学药学院，沈阳 110000；3.辽宁中医药大学药学院，大连 116600）

[目的]确立齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物的最佳水解工艺，并对水解后的苷元进行含量测定。[方法]通过正交实验设计确定齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物的最佳酸水解条件，利用此酸水解条件，对齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物进行酸水解，并采用高效液相色谱法对水解产物中的3种苷元进行含量测定。[结果]确定齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物的最佳酸水解条件为：盐酸-甲醇浓度为4.0 mol/L，水解温度为78℃，水解时间为4 h，经过HPLC法测定，水解产物算得到酸法水解后总黄酮苷元的平均含量为58.38%±1.34%，其中木犀草素为12.06%±1.43%，槲皮素为9.66%± 0.32%，芹菜素为36.66%±2.34%。[结论]该水解方法可有效水解齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物，HPLC测定方法准确、可靠，可作为控制齿叶白鹃梅叶总黄酮水解产物质量的定量依据。

齿叶白鹃梅；总黄酮；酸水解；含量测定

齿叶白鹃梅（Exochorda serratifolia S.Moore.），是蔷薇科绣线菊亚科白鹃梅属植物[1]，主要生长在辽宁凌源、喀左及河北一带，其花蕾和幼叶可食用。民间多用其预防和治疗糖尿病。本课题组对其化学成分进行了分离，从中得到芦丁、木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷等十几种黄酮类化合物[2-3]。同时本课题组对齿叶白鹃梅叶进行了药理活性研究，证明其确有改善小鼠耐糖量和降血糖的作用[4]。

前期采用大孔树脂法对齿叶白鹃梅中的总黄酮进行富集和纯化，得到总黄酮提取物，采用分光光度法测得提取物中总黄酮的含量达到60%左右。由于总黄酮提取物中含有较多的分别以芹菜素、木犀草素和槲皮素为苷元形成的多种苷，本实验对这些黄酮苷的水解条件进行研究，通过水解使黄酮苷转化成木犀草素、槲皮素、芹菜素3种黄酮苷元，并用高效液相色谱法测定这3种苷元含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（包括真空脱气机、四元泵、柱温箱、VWD、HP1100化学工作站）（美国安捷伦科技有限公司），CP225D型电子天平（Sartorius，十万分之一）。

1.2 试药 木犀草素、槲皮素、芹菜素对照品（批号分别为20120206,20120213,20120314，上海源叶生物科技有限公司），齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物（总黄酮含量为60.51%），水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物水解工艺考察

2.1.1 供试品溶液的制备和色谱条件 供试品溶液的制备，称取100 mg齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物，加入一定浓度的盐酸-甲醇溶液，于一定温度的水浴中反应一定时间，冷却后过滤，用甲醇定容至50 mL，过0.45 μm滤膜后用HPLC检测，通过正交试验确定最佳酸水解条件。

色谱条件如下，色谱柱Promosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-2%冰乙酸梯度洗脱（梯度洗脱程序见表1），柱温25℃，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，检测波长267 nm。

2.1.2 水解工艺考察 水解时间的确定，固定水解温度为78℃，盐酸浓度为5.0 mol/L，分别水解1、2、3、4、6 h，用HPLC检测，计算水解率，结果见图1。由图1可知，水解时间为2～4 h水解效果较好[5-7]。

水解率=（水解后总苷元-水解前总苷元）/水解后总苷元

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program for mobile phase

图1 水解时间的影响Fig.1 Effect of hydrolysis time

盐酸浓度的确定方法如下，固定水解温度78℃，盐酸浓度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mol/L，水解2 h，用HPLC检测，计算水解率，结果见图2。由图2可知，盐酸浓度为3.0～5.0 mol/L水解效果较好。

图2 盐酸浓度的影响Fig.2 Effect of the concentration of hydrochloric acid

水解温度的确定如下，固定盐酸浓度为5.0 mol/L，温度分别为48、58、68、78、88℃，水解2 h，用HPLC检测，计算水解率，结果见图3。由图3可知，水解温度为58～78℃水解效果较好。

2.1.3 正交实验 考察多因素的综合效果，以L9（33）正交实验表安排实验（见表2），实验结果及方差分析分别见表3、表4。

图3 水解温度的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature

表2 正交实验因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物水解正交实验及结果Tab.3 The result of hydrolysis flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves orthogonal experiment

表4 正交实验方差分析表（F0.05=34.402）Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment（F0.05=34.402）

由表3可以看出，R2＞R3＞R1，即在影响水解率的因素中，盐酸-甲醇浓度的影响程度最大，水解时间其次，水解温度最次。从表4也可以看出，PB＜0.05，PA，PC＞0.05，说明盐酸-甲醇浓度是影响水解程度的主要因素，且具有统计学意义。将K值进行比较，KA3＞KA2＞KA1，KB2＞KB3＞KB1，KC3＞KC1＞KC2，由此可得三因素的最佳水平组合为A3B2C3，即酸法水解最佳工艺条件为：盐酸-甲醇溶液的浓度为4.0 mol/L，水解时间为4 h，水解温度为78℃。

2.2 水解产物中3种黄酮苷元的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱PromosilC18色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-2%冰乙酸（27∶73）；柱温25℃，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，检测波长267 nm[6，8-9]。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取木犀草素、槲皮素、芹菜素11.85、10.92、11.70mg，甲醇定容至25mL，摇匀，即得3种对照品溶液，浓度分别为0.474 0、0.436 8、0.468 0 g/L，备用。

2.2.3 供试品溶液制备 精密称取齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物100 mg，加入4.0 mol/L盐酸-甲醇溶液50 mL，于78℃的水浴中反应4 h，冷却后过滤，用甲醇定容至50 mL，过0.45 μm滤膜，即得。

2.2.4 线性范围的考察 取上述3种对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10、20 μL，经HPLC检测后，分别以进样量为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，得回归方程，见表5。

表5 标准曲线表Tab.5 Table of standard curve

2.2.5 精密度实验 取各对照品溶液，分别连续进样6次，以峰面积计算RSD值。结果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的RSD值均小于2.0%。

2.2.6 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、16、24 h进样，测定峰面积，计算RSD值均小于2.0%。

2.2.7 重复性实验 取同一批样品5份，分别测定木犀草素、槲皮素、芹菜素含量，计算RSD值均小于2.0%。

2.2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品6份，分别精密加入3种对照品溶液，测定含量，并计算回收率。结果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的平均加样回收率分别为95.2%±0.76%，94.7%±0.54%， 97.5%±0.54%，RSD值均小于2.0%。

2.2.9 样品含量测定 取3批供试品溶液，利用上述确定的水解条件进行酸水解。采用HPLC法检测水解产物中槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量，计算得到酸法水解后总黄酮苷元的平均含量为58.38%±1.34%，其中木犀草素为12.06%±1.43%，槲皮素为9.66%±0.32%，芹菜素为36.66%±2.34%。

图4 水解前后样品色谱图及各对照品色谱图Fig.4 Chromatogram of the sample before and after hydrolysis and reference substance solution

3 讨论

本实验通过正交实验设计，确立了齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物的最佳酸水解条件。利用该水解工艺对总黄酮提取物进行酸水解，使提取物中多种由木犀草素、槲皮素和芹菜素与糖组成的黄酮苷转化为相应的苷元。同时，建立3种苷元的HPLC测定方法，对3种苷元进行含量测定。

实验结果表明，该水解工艺可以有效的水解齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物，HPLC法分析样品中木犀草素、槲皮素和芹菜素3种苷元，方法简便、重复性好，回收率高，可作为控制齿叶白鹃梅叶总黄酮水解产物质量的定量依据。

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Study on acid hydrolytic conditions of total flavonoids and the determination of flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves

LI Gu-yue1,2，LIU Jia-xin1,2，CAI Qian3
（1.The First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110000,China;2.Pharmacy College of China Medical University, Shenyang 110000,China;3.Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China）

[Objective]To establish the acid hydrolytic conditions of total flavonoids and to determine the flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves.[Methods]The acid hydrolytic conditions were optimized by the means of orthogonal test and the contents of the flavonoid aglycones were determined by HPLC.[Results]The optimum conditions of acid hydrolysis were:concentration of hydrochloric acid 4.0 mol/L,temperature 78℃,time 4 h.The contents of luteolin,quercetin and apigenin were 12.06%±0.32%,9.66% ±1.43%and 36.66%±2.34%respectively.[Conclusion]This method is accurate and reliable and can be used in the determination of the flavonoid aglycones in Exochorda serratifolia S.Moore.leaves.

Exochorda serratifolia S.Moore;flavonoids;acid hydrolysis;content determination

R284.2

：A

：1672-1519（2014）05-0306-04

2013-12-25）

（本文编辑：高 杉，张震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.05.18

国家自然科学基金项目（81202919）。

李古月（1984－），女，药师，从事临床制剂指导工作。