UPLC/Q-TOF-MS和PLS-DA在鸦片生物碱检测及分类判别中的应用

刘翠梅，花镇东，白燕平

（1.中国人民公安大学 刑事科学技术系，北京 100038；2.公安部禁毒情报技术中心国家毒品实验室，北京 100193）

鸦片（opium），又叫阿片，俗称大烟，源于罂粟植物蒴果，其所含主要生物碱吗啡是生产毒品海洛因的原材料。鸦片中除吗啡外还含有可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可汀4种常量生物碱和多种痕量生物碱如：牛心果碱、劳丹素、那碎因等。这些常量和痕量生物碱是推断鸦片产地和海洛因的植物源产地（生产海洛因所用鸦片的产地）的重要判别指标[1-2]。

传统的鸦片中生物碱的检测方法主要有气相色谱法（GC）[3]、液相色谱法（HPLC）[4]、毛细 管电泳法（CE）[5]等。由于受检测方法的限制，以往鸦片样品分析主要关注常量生物碱，而较少关注痕量生物碱。近年来液质联用分析技术已广泛用于毒品及生物样品的分离分析[6-7]，新发展起来的超高效液相/四极杆飞行时间串联质谱仪联用技术（UPLC/Q-TOF-MS），集UPLC快速有效的色谱分离能力和Q-TOF高分辨质谱灵敏度高、定性能力强的优势于一体[8]，必将成为毒品样品特征分析最有效的分析手段之一。

本文首次建立了一种同时检测鸦片样品中17种常量和痕量生物碱UPLC/Q-TOF-MS方法，根据精确分子量、二级碎片离子、色谱保留时间分析来实现各生物碱的定性鉴定，并结合多变量模式识别方法中的偏最小二乘法（PLS-DA）找到不同地域鸦片样品中生物碱的差异，建立了判别国产鸦片和缅甸产鸦片的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

5600Triple TOF高分辨四极杆与飞行时间质谱仪（美国 AB Sciex）；Analyst TF 1.6 和 Multiquant数据处理系统（美国AB Sciex）；30A超高效液相色谱分析系统（日本岛津）。

乙腈（色谱纯）；甲酸铵（HPLC 级，纯度＞99%）。

盐酸吗啡、盐酸乙酰可待因、罂粟碱、磷酸可待因、那可汀（公安部物证鉴定中心）；波尔定碱（FLUKA，纯度＞98%）；丽春花定碱（Chromadex，RG）；血根碱、原阿片碱（上海同田生物技术股份有限公司，纯度98%）；牛心果碱（凯利得生物医药技术（上海）有限公司）纯度 97%，DL-劳丹素（ChromaDex，RG）；氢可它宁（ChromaDex，RG）；DL-去甲基劳丹素（Aldrich）；金黄紫堇碱（Toronto Research Chemicals Inc）；可待民碱，那碎因，罌粟啶三种对照品为国家毒品实验室合成制得。

1.2 方法

1.2.1 样品选取

本文选取了缅甸产鸦片200份，国内产鸦片样品78份。国产鸦片包括甘肃鸦片19份，河北17份，内蒙23份，四川10份，贵州9份。

1.2.2 溶液配制

准确称取各标准品配成1 mg/mL单标储备液，在5℃保存。移取适量的标准储备液，用初始比例流动相配成100μg/L的工作液。

1.2.3 样品处理

鸦片样品于55℃真空干燥，干燥后用玛瑙研钵研磨均匀。称取150mg的鸦片样品，加入15mL的甲醇，浸泡过夜，超声30min，用初始比例的流动相将样品稀释100倍，过0.2μm滤膜，进UPLC/Q-TOF-MS分析。

1.3 条件

1.3.1 色谱条件

液相条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1mm×100mm，1.8μm）；进样体积：1μL；柱温：40℃；流动相 A：10 mM 甲酸铵（pH=5.1），流动相 B：乙腈；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～1.0 min， 85%B；1.0～6.0 min，85%～68%B；6.0～9.0 min，68%～30%B；9.0～10.0 min，30%～5%B；10.0～11.0 min，5%B；11.0～12.0min，5%B～85%B；12.5～15.0min，85%B。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子全扫描及二级质谱扫描。 离子喷雾电压：5.5kV；去簇电压（DP）：80 V；喷雾温度：600 ℃；雾化气（N2，GS1）流速：50 psi；脱溶剂气（N2，GS2）流速：50 psi，气帘气（CUR）流速：30 psi；质量轴：100～1000amu；一级质谱碰撞能量（CE）：10V；二级质谱碰撞能量（CE）：40V±15V。

1.3.3 数据处理

各生物碱色谱峰处理采用peakview和multiquant软件（美国AB Sciex），通过导入离子峰并适当调整积分参数的方式完成色谱峰的识别与峰匹配，得到各个化合物的峰面积值。

不同产地鸦片样品的分类和变量的比较选用SIMCA-P软件的偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）进行分析。

2 结果和讨论

2.1 UPLC分离条件的优化

实验初期，分别采用对甲醇、乙腈、甲酸体系、甲酸铵体系、乙酸铵体系、甲酸-甲酸铵体系、乙酸乙酸铵体系进行比较，最终发现纯甲酸铵和乙酸铵体系条件下各生物碱的分离条件最好，最终选取10 mM甲酸铵（pH=5.1）体系作为最终的缓冲体系。图1是某鸦片样品的UPLC-Q-TOF总离子流图。

图1 鸦片样品的UPLC/Q-TOF-MS总离子流图

2.2 化合物的定性

UPLC/Q-TOF-MS质谱可以提供化合物的保留时间、MS/MS碎片离子、精确质量数等信息，这些信息可为化合物的准确定性提供充分的依据。鸦片中生物碱的信息见表1。通过保留时间、准确分子量和二级谱图实现对各生物碱的定性。各生物碱的质量数偏差均在2ppm以内。

表1 生物碱的质谱分析参数

2.3 不同产地鸦片分类结果

本文选取了国内产的鸦片样品78份和缅甸产鸦片200份。常量生物碱的平均色谱峰面积百分比均值约为10%～20%之间，痕量生物碱中牛心果碱、劳旦宁、劳丹素的平均面积百分比约为1%～3%之间，其他痕量生物碱的平均峰面积百分比约为0.05%～1%。结果见表2。

表2 不同产地鸦片样品生物碱平均峰面积百分比

通过AB 5600的Multiquant软件导出各生物碱的峰面积数据，采用SIMCA-P软件对生物碱峰面积的数据进行PLS-DA分析，其中X矩阵为各生物碱的峰面积数据；Y矩阵为各样品的类别，将国内产鸦片的类别定义为1，缅甸产鸦片的类别定义为2。X矩阵数据在计算前先进行归一化处理，归一化方法为每个化合物的峰面积值减去其峰面积均值，除以其标准方差。

PLS-DA通过交叉验证的方式自动拟合得到三个主成分（t1，t2，t3），三个主成分的 R2X 值（所解释 X矩阵信息的比例）、R2Y值（所解释Y矩阵信息的比例）和 Q2值（模型的预测能力）依次为：t1（R2X=16.3%，R2Y=57.3%，Q2=54.1%），t2（R2X=25%，R2Y=5.3%，Q2=8.9%），t3（R2X=8.6%，R2Y=3.7%，Q2=3.7%）。 三个主成分（t1，t2，t3）累积值（R2X=49.9%，R2Y=66.3%，Q2=59.7%）。Q2值是PLS-DA模型最重要的参数，Q2值越大表明模型的预测能力越强。结果表明该模型的预测能力较好。

依据PLS-DA模型的相关性系数值可以得到预测模型为 y=0.042×Morphine-0.17×Oripavine+0.24×Codeine+0.13×Hydrocotarnine+0.13×Reticuline+1.26×Codamine-0.1×Laudanidine+0.052×Narceine-0.14×Boldine-0.27×Thebaine+0.27×Cryptopine-0.19×Norlaudanosine-0.055×Papaveraldine-0.11×Laudanosine+0.079×Papaverine+0.050×Protopine+0.044×Noscapine（注：公式中各生物碱的值为其峰面积归一化后得到的值）。模型的判别阈值为0，当y＞0时为国内产鸦片，当y＜0时为缅甸产鸦片。该模型判别的正确率为96%，准确度高。

从由t1和t2组成的“PLS-DA分类图”（见图2）可以看出国内产鸦片与缅甸产鸦片有明显差异，国内产鸦片主要分布在右上侧，缅甸产鸦片主要分布在左下侧。

图2 鸦片样品PLS-DA分类图

从“PLS-DA因子载荷图”（见图3）同时结合“不同产地鸦片样品生物碱平均峰面积百分比”（见表2）可以看出，可待民碱、可待因、吗啡、牛心果碱、罂粟碱在国产鸦片中的含量相对较高，而蒂巴因、东罂粟碱、波尔定碱、去甲基劳丹素在缅甸产鸦片中的含量相对较高。其中可待民碱、牛心果碱、东罂粟碱、波尔定碱、去甲基劳丹素这6种痕量生物碱含量在两地区鸦片样品中有显著性差异，由此可见痕量生物碱是区分鸦片产地的重要变量。

图3 鸦片样品生物碱载荷图

3 结论

综上所述，本文首次建立了UPLC/Q-TOF-MS法测定鸦片中17种常量和痕量生物碱的方法，通过保留时间、精确质量数和二级碎片离子对各化合物定性分析，并采用PLS-DA法实现了国产鸦片和缅甸产鸦片的产地判别。结果表明：国产鸦片中可待因、可待民碱、吗啡、牛心果碱、罂粟碱的含量相对较高，而缅甸产鸦片中蒂巴因、东罂粟碱、波尔定碱、去甲基劳丹素的含量相对较高。

该方法简便、快速、灵敏，是一种有效的区分国产鸦片和缅甸产鸦片的手段，同时该研究也为进一步建立国产海洛因和缅甸产海洛因的植物源产地判别方法提供了科学依据。

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