Skp2在鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

邢 岳王纾宜△许祖德

(1复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科 上海 200031；2复旦大学附属华山医院病理科 上海 200040)

Skp2在鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

邢 岳1王纾宜1△许祖德2

(1复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科 上海 200031；2复旦大学附属华山医院病理科 上海 200040)

目的探讨Skp2与鼻型NK/T细胞淋巴瘤的预后及其他临床特点之间的关系。方法收集95例鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者临床病理学资料,用免疫组化方法检测肿瘤石蜡包埋标本的EB病毒编码RNA(EBV encoded RNA,EBER)、Skp2及Ki-67的表达情况,将Skp2阳性细胞比率超过50%的病例计入高表达组,低于50%的计入低表达组,分析患者的预后、EBER表达状态与Skp2、Ki-67表达率之间的关系。结果在Skp2高表达组,中位生存期为20.54个月(95%CI：18.49-22.59),1年总体生存率为76%；在Skp2低表达组,中位生存期为17.54个月(95%CI：20.31-22.24),1年总体生存率为71%；在Skp2阴性组,中位生存期为个21.71个月(95%CI：11.15-16.18),1年总体生存率为91%。生存分析显示,Skp2高表达组与Skp2阴性组间差异具有统计学意义(P=0.035)。结论Skp2的高表达可能是鼻腔NK/T细胞淋巴瘤预后的不良因素。

Skp2； Ki-67； EB病毒编码RNA(EBER)； 鼻型NK/T细胞淋巴瘤

鼻型NK/T细胞淋巴瘤(nasal type natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL)是一种特殊类型的非霍奇金恶性淋巴瘤,其肿瘤组织常侵犯鼻腔和上呼吸道和消化道,预后较差［1-2］。鼻型NK/T细胞淋巴瘤在欧美国家罕见,而在亚洲、墨西哥及南美洲地区相对多见。据报道,其在亚洲的发病率占到非霍奇金恶性淋巴瘤的2.6%～10.7%,占鼻咽部肿瘤的40%～70%。这很可能与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染的地理分布特点有关［3］。

鼻型NK/T细胞淋巴瘤的发病与EB病毒感染有密切的关系,与鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤相似,其EB病毒表现出Ⅱ型潜伏感染的特征,EB病毒的致瘤机制至今仍未完全阐明。一些研究发现：EB病毒通过与泛素蛋白酶系统的相互作用来维持其潜伏感染,并且活化特定癌基因,使得泛素依赖性蛋白降解系统失效［3-4］。

S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)属于F-box蛋白家族,由F-box序列、Linger序列及亮氨酸重复序列结构域(Leucinerich-repeat,LRR)组成。Skp2则可以特异性识别并降解SCF(skp-cullin-F-box蛋白)复合体磷酸化底物P27,介导泛素化降解,调控细胞周期［5］。Skp2同时也是一种与淋巴瘤发生有关的癌基因［6］。P27是关键的细胞素依赖性激酶抑制子,可以在G1/S检查点阻断细胞周期进展。先前报道指出,P27的下调与多种肿瘤的预后相关,包括结肠癌、乳腺癌和前列腺癌。

近期,一些研究指出某些EB病毒编码的蛋白可以调节Skp2依赖性泛素化,并且破坏哺乳动物细胞中的P27蛋白。这一证据提示鼻型NK/T细胞淋巴瘤的EB病毒潜伏感染可能导致Skp2与P27蛋白表达的失衡,从而促进肿瘤进展。Ki-67是一种与核增殖相关的抗原,表达于细胞周期的生长期与合成期,在G0期(静息期)不表达［7］。尽管在既往研究中Ki-67的标记指数从4%～22%不等,但它仍为一种可靠的细胞增殖标记物［8］。

关于Skp2在鼻型NK/T细胞淋巴瘤的表达,其与EB病毒编码RNA(EBV encoded RNA,EBER)表达,以及肿瘤的预后相关性,目前尚不清楚。本次研究通过免疫组化的方法,探讨鼻型NK/T细胞淋巴瘤组织中Skp2和EBER的相关性,并进一步研究联合检测Skp2和Ki-67对于预后的指导意义。

材料和方法

研究对象选取从2011年1月1日至2011年12月31日在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院确诊的、有完整临床病例资料且肿瘤组织充分的95例(鼻型NK/T细胞淋巴瘤)纳入研究。所有病例均经2名经验丰富的病理医生作出诊断。

免疫组化染色（Skp2、ki67） 活检标本均经4%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋。免疫组化染色依照Envision两步法,石蜡标本经脱蜡,梯度乙醇脱水、血清孵育后,滴加相应一抗,50μL/片,室温下孵育1 h,4℃放置过夜,室温平衡15 min,0.05 mol/L PBS(p H7.6)洗涤5 min×3次,滴加两步法检测系统En VisionTM/HRP)于组织上,50μL/片,37℃1 h。用PBS冲洗切片。Skp2阴性对照采用PBS,阳性对照采用扁桃体组织。Skp2主要定位于胞核,少数定位于胞质。每例切片均在高倍镜下计数阳性细胞。Skp2阳性细胞比率超过50%的病例被计入高表达组中,低于50%的计入低表达组中［9］。Ki-67阴性对照采用PBS,Ki-67定位于胞核,每例切片均在高倍镜下计数阳性细胞。Ki-67阳性细胞比率超过50%的病例被计入高表达组中,低于50%的计入低表达组中。所有阳性细胞均经2名经验丰富的病理医生双盲计数。

原位杂交检测EBER标本脱蜡水化后,用25 μg/m L的蛋白酶K(Merck公司产品),37℃消化10 min,水洗,根据标本大小,每片滴加10～20μL杂交液,蜡膜覆盖,橡胶水封边,70℃变性8 min,37℃杂交过夜。在室温下各洗脱10 min×2次,去除未杂交信号。设置杂交液中无标记探针为阴性对照。参照Dig-DNA标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim公司,Cat.No.1093657)的方法检测。2%的正常羊血清室温封闭20 min后,用BufferⅠ1∶2 000稀释的地高辛抗体37℃孵育30 min, BufferⅠ洗3次,每次5 min；BufferⅢ中浸泡5 min后,加BufferⅢ稀释的NBT/BCIP显色液30 m L,暗湿盒中显色1～3 h,缓冲液Ⅳ终止反应,空气晾干,4℃保存。

统计分析采用SPSS17.0软件进行数据分析。单因素生存分析采用Kaplan Meier法评估生存可能性,采用Log-rank分析意义。相关分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

临床病理学特征共有95例鼻型NK/T细胞淋巴瘤纳入研究,其人口和年龄组成、肿瘤生长部位及临床病理学特征如下：男性71例,女性24例,男女比例为2.9∶1；年龄为16～86岁(只有1例为20岁以下),平均(55±15.37)岁,其中67例肿瘤生长位于鼻腔,13例位于鼻咽处,11例位于咽喉部；共有76例患者感染EB病毒,感染率为80%。我们对所有的病例进行1年随访,失访患者26例。所有95例患者均进行了HE、Skp2、Ki-67和EBER免疫组化染色(图1),其中Skp2的阳性率为44%,Ki-67的阳性率为99%,确诊时共有63例的血清LDH水平,其中53例为正常,10例升高。

单因素生存分析利用Kaplan Meier法分别对性别、年龄(≤60岁和＞60岁)、部位、Skp2的表达程度(高、低)、Ki-67的表达程度(高、低、阴性)、EB的感染(阳性、阴性)以及LDH(升高、正常)进行了生存分析。结果发现：与Skp2阴性组相比,Skp2的高表达提示预后不良(χ2=6.770,P=0.035),年龄＞60岁组的预后不良(χ2=5.076,P=0.025),均具有统计学意义,其余因素未发现有统计学意义(表1、图2)。

Skp2与EBER的相关性分析我们对Skp2表达高低、EBER以及Ki-67进行了Spearman相关性分析。发现Skp2表达与Ki-67呈正相关(Pearson相关系数为0.290,P=0.011),而与EBER无显著的相关(Pearson相关系数为0.115,P=0.264,表2)。

讨 论

Skp2由Demetric于1995年通过荧光原位杂交法发现,它是一种核蛋白,也是细胞周期的关键调节因子。Skp2包括一个F盒、10个富含亮氨酸的重复序列及一个C末端的模体,是SCF(Skp1-Cullin-F-box,SCF)复合物的底物识别亚单位,能够识别并降解P27,后者的下调与多种肿瘤的预后相关［10-13］。

细胞周期失控在肿瘤的发生中有一定的意义,而Skp2是介导泛素化降解,调控细胞周期的重要蛋白。之前的研究指出Skp2与一些恶性肿瘤的预后呈负相关,在这些肿瘤中,Skp2的表达程度是独立预后因素。这些研究的主要对象是上皮性肿瘤,包括喉癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、泌尿道移行上皮癌以及一些软组织肉瘤［14-18］。近些年来,研究者开始探讨Skp2的表达与非霍奇金淋巴瘤,主要是弥漫大B细胞淋巴瘤及白血病的预后关系［19-21］。研究表明,Skp2的表达程度与淋巴瘤的进展和预后相关,在生长相对缓慢的淋巴瘤中,Skp2的表达低,而在浸润性进展性淋巴瘤中,Skp2的表达则相对较高。在动物模型中,也发现Skp2转基因小鼠表现出较高的肿瘤发生率,其存活时间降低。在本次实验中,我们收集的患者皆为鼻型NK/T细胞淋巴瘤,结果显示,Skp2高表达组患者的预后较Skp2阴性组患者的预后差,这一点与之前研究所指出的Skp2的表达与非霍奇金淋巴瘤进展相关的观点一致,也为Skp2的高表达是结外NK/T细胞淋巴瘤的不良预后因素这一观点提供了更有力的证明。之前的研究发现Skp2高表达组淋巴瘤患者的预后较Skp2低表达组淋巴瘤患者的预后差,在本次实验中,我们并未发现这样的差异,部分原因可能是因为Skp2低表达组患者的失访率过高、随访时间有限所致。这一观点有待于扩大样本量,及临床病例资料更完备的实验进一步验证。

EB病毒感染状态与鼻型NK/T细胞淋巴瘤的发病有密切关系,本研究中,EB病毒的感染率达到79%。研究发现,EBV编码蛋白促使依赖于Skp2的泛素化,降低P27的表达,还可介导细胞周期蛋白E2F1的表达［22］。E2F1在非霍奇金恶性淋巴瘤中表达,其可以下调Skp2的表达,与预后有一定的相关性［23］。在本研究中,Skp2的表达率为47%,经统计学分析,与EBER感染状态无明显相关性,与之前的研究有些出入［24］。造成这一现象的原因可能与随访资料的局限性及随访时间不够长有关,EB病毒感染与Skp2在鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生过程中相互作用的机制有待进一步阐明。

既往研究发现在胃肠道间质瘤及其他一些间质性肿瘤中,Skp2与Ki-67表现出强相关性［25-27］。本次实验发现,鼻型NK/T细胞淋巴瘤Skp2与Ki-67的表达有相关性(P＜0.025)。在将来的研究中,可以在更庞大、更完整的淋巴瘤临床病理资料中继续查证Skp2表达与Ki-67及其他恶性细胞参数的相关性,以探索Skp2是否可作为评价肿瘤恶性程度及侵袭性的一种辅助指标。

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The expression and clinical significance of Skp2 in nasal type NK/T-cell lymphoma

XING Yue1,WANG Shu-Yi1△,XU Zu-De2
(1Department of Pathology,Eyes,Ears,Nose and Throat Hospital,Fudan University,Shanghai 200031,China；
2Department of Pathology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To discuss the correlation between Skp2 and the prognosis and other clinicopathological features of nasal type NK/T-cell lymphoma.MethodsWe collected the clinicopathological data of 95 cases of nasal type NK/T-cell lymphoma,detected the expression of EBV encoded RNA(EBER),Skp2 and Ki-67 of paraffin-embedded tissue of tumors using immunohistochemical method.The cases with the Skp2-positive rate of tumor cells above 50%were classified into high expression group,those with below 50%were classified into low expression group. We analyzed the correlation between the expression of Skp2 and Ki-67,and the prognosis or EBER status.ResultsIn the high expression group,the mean overall survival was 20.54 months(95%CI：18.49-22.59),the 1-year overall survival rate was 76%.In the low expression group,the mean overall survival was 17.54 months(95%CI：20.31-22.24),the 1-year overall survival rate was 71%.In the negative expression group,the mean overall survival was 21.71 months(95%CI：11.15-16.18),the 1-year overall survival rate was 91%.There was statistical difference between Skp2 high expression group and Skp2 negative expression group(P＜0.01).ConclusionsThe high expression of Skp2 maybe an independent unfavorable prognosis factor of nasal type NK/T-cell lymphoma.

Skp2； Ki-67； EBV encoded RNA(EBER)； nasal type NK/T-cell lymphoma

R 73

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.010

2013-03-29；编辑：张秀峰)

△Corresponding author E-mail：sywangsh@hotmail.com