不同时段社交应激对小鼠肺癌生长的影响

吴 晓 刘宝君 吴金峰 厉 蓓 弓唯一 徐海林 段晓虹 董竞成

(复旦大学附属华山医院中西医结合科 上海 200032)

不同时段社交应激对小鼠肺癌生长的影响

吴 晓 刘宝君 吴金峰 厉 蓓 弓唯一 徐海林 段晓虹 董竞成△

(复旦大学附属华山医院中西医结合科 上海 200032)

目的观察不同时段社交应激对小鼠肺癌生长的影响。方法将36只C57BL/6J小鼠随机分为A组(正常对照组)、B组(单纯抑郁组)、C组(瘤前应激组)、D组(单纯肿瘤组)、E组(瘤后应激组)、F组(5天应激组),每组6只。在10天社交应激模型的基础上,C、D、E组分别在应激前、应激5天和10天后给予皮下种瘤。ELISA方法检测各组小鼠血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达, Western blot方法检测肺组织中磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p ERK)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白的表达,real-time PCR方法检测血管内皮生长因子受体2(VEGFR2) m RNA%和L1细胞黏附分子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)等参数。结果C组和F组与其他各组比较,皮下肿瘤结节的重量、体积及与肿瘤生长有关的上述细胞因子的表达均明显升高(P＜0.05)。E组与D组比较,两者在肿瘤结节的重量、体积及相关细胞因子的表达上差异不大(P＞0.05)。结论发生在肿瘤发生之前及发生过程中的社交应激对小鼠肺癌有显著的促生长作用,其内在机制有待进一步研究。

社交应激； 肿瘤生长； 社会心理因素； 细胞因子

在所有肿瘤疾病中,肺癌发病率居首位［1］,属于全球范围内的高发性疾病。抑郁、焦虑等社会心理因素被认为会影响疾病的发生和发展［2］。多项研究证实,社会心理因素不仅与肿瘤疾病的发生有关,而且还参与到肿瘤发展的各个阶段［3］。同时,在肿瘤患者中也存在较高的抑郁症发病率,其症状的发展被证明与肿瘤患者的预后息息相关［4］。肿瘤患者在经受肿瘤带来的痛苦的同时,往往还要承受随之发生的心理变化和影响,尤其是一些负面的社会心理因素,对疾病发展和转归都有不利影响［5］,甚至有患者在疾病康复后仍然受到社会心理因素的负面影响［6］。虽然社会心理因素对肿瘤生长的影响早已为科研及医务工作者所重视和研究［7-12］,但是其在肿瘤发展不同阶段的干预和影响鲜见报道。

本文通过模拟人类在社交应激压力作用下的心理应激状态,多次给予实验小鼠社交失败应激刺激,通过观察和分析与人类相似的抑郁样症状,建立模拟人类抑郁状态的社交应激性抑郁动物模型。通过在肿瘤发展的不同阶段给予社交应激干预,将小鼠肿瘤模型与社交应激性抑郁模型相结合,观察与肿瘤发生和发展相关的若干指标,探讨社会应激在肿瘤发展的不同阶段对肿瘤生长的影响,从而为肿瘤伴发心理性疾病的治疗提供一定的理论基础。

材料和方法

实验动物及设备6周龄雄性C57BL/6J小鼠(简称“C57小鼠”,上海斯莱科公司,许可证编号：2008001622124)；Noldus动物行为学视频跟踪系统(复旦大学上海医学院神经生物研究院)；透明带孔有机玻璃隔板及鼠笼(上海移数信息科技有限公司)；CD-1退役种鼠,雄性,4～6月龄［北京维通利华公司,许可证编号：SCXK(京2011-0011)］；SYBR Green PCR试剂盒(美国MBI公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；real-time检测仪(型号：ABI-7500,美国ABI公司)；生物安全柜(型号：TYPE B2,美国Sigma公司)；低温冷冻离心机(型号：1-15K,美国Sigma公司)；手持式匀浆机(型号：F6/ 10,德国FLUKO公司)。

C57小鼠肺癌模型的建立将非小细胞肺癌系肿瘤细胞3LL培养于含10%胎牛血清的1640培养基中至对数生长期,收集肿瘤细胞,调整细胞浓度为1×107/m L,制备单细胞悬液。用1 m L空针在C57小鼠左腋皮下接种肿瘤细胞悬液,每只2× 106/0.2 m L。

动物分组将36只C57小鼠随机分为A组(正常对照组)、B组(单纯抑郁组)、C组(瘤前应激组：先应激后皮下种瘤)、D组(单纯肿瘤组)、E组(瘤后应激组：先皮下种瘤后应激)、F组(5天应激组：先应激5天,种瘤后再应激5天),同时将24只CD-1退役种鼠与B、C、E、F组对应随机分组。将各组小鼠饲养于标准SPF级环境中,使C、D、E、F组小鼠在同一天用同一批次肿瘤细胞皮下种瘤。

社交应激模型的建立将单只CD-1小鼠放于中间有透明带孔隔板的鼠笼一侧饲养,单笼饲养7天。将一只C57小鼠放入对应组CD-1小鼠鼠笼的一侧,接受CD-1小鼠的刺激,5～10 min后将C57小鼠放于鼠笼中透明带孔隔板的另一侧,相处过夜24 h,同一只C57小鼠连续10天接受不同CD-1小鼠的刺激。实验过程中,不改变CD-1小鼠所饲养的鼠笼,每天将C57小鼠放入不同CD-1小鼠鼠笼中接受刺激,建模流程见图1。建模最后一天,所有C57小鼠单笼饲养,24 h后进行行为学检测。

C57小鼠行为学检测将空的透明鼠笼放于社交应激旷场边缘的中间位置,将一只待测C57小鼠放于社交应激旷场的中央位置,打开Noldus动物运动轨迹跟踪系统,记录150 s内C57小鼠在旷场内的运动轨迹。取出C57小鼠,将一只未攻击过C57小鼠的CD-1小鼠放入旷场边缘的透明鼠笼内,将同一只C57小鼠再次放入旷场中的相同位置,再次记录150 s内C57小鼠在旷场中的运动轨迹。每次行为学检测结束后,用酒精棉球清理旷场及鼠笼以消除上一只小鼠留下的气味。行为学测试结束后,CD-1小鼠和C57小鼠分别单笼饲养。

处死取材各组C57小鼠饲养31天后,眼球取血,1 500 r/min离心15 min(离心半径5 cm),取上清保存于EP管中,-80℃冻存。将各组C57小鼠的肺组织取出,放入-80℃冰箱中冻存。剥离C、D、E、F组C57小鼠的皮下肿瘤结节,测量长短径并称重,同时将肿瘤组织冻存。

ELISA检测运用ELISA方法检测小鼠血清中VEGF的表达。按照妙通公司VEGF ELISA试剂盒的Protocol操作,全自动酶标仪在450 nm处检测各孔的吸光度(D)值。

Westernblot检测运用Western blot方法检测各组小鼠肺组织中p Erk、MMP-2及MMP-9蛋白的表达。将肺组织细胞裂解,提取组织蛋白,定量和分离,转膜后分别与相应蛋白抗体孵育并显色。

real-timepCR检测运用real-time PCR方法检测肺组织中VEGFR2mRNA和L1 CAM mRNA的表达。剪取米粒大小的肺组织转移至去核酶试管中,加入预冷的Trizol,用Trizol法提取总RNA,逆转录合成样本cDNA。50μL PCR反应体系包括：realtime PCR MIX 32μL,上游、下游引物各2μL,探针1 μL,cDNA模板2μL,dd H2O 13μL。PCR反应条件为：95℃2 min,95℃15 s,60℃20 s,循环40次。

统计学处理用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计,采用One-way ANOVA方法进行检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

实验流程将实验小鼠随机分为6组,根据不同分组在社交应激造模的不同阶段给予小鼠皮下种瘤,31天后处死实验小鼠,取材并分析,实验流程见图2。

各组小鼠行为学比较B、C、E、F组C57小鼠在社交区(interaction zone)和角落区(corner zone)的停留时间在应激鼠CD-1存在和不存在的情况下明显不同,差异有统计学意义(P＜0.05,图3)。在CD-1小鼠出现后,B、C组C57小鼠在社交区停留时间的变化尤为明显(P＜0.01)；在CD-1小鼠存在和不存在的情况下,A、D组C57小鼠在社交区和角落区停留时间的变化不大,差异无统计学意义(P＞ 0.05)。图3C中1、2分别是非应激组和应激组小鼠在CD-1小鼠不存在时,在社交应激旷场中的运动轨迹,图中可见,两组小鼠的运动轨迹在社交应激旷场中均匀分布；3、4图分别是非应激组和应激组小鼠在CD-1小鼠存在时,在社交应激旷场中的运动轨迹,图中可见,非应激组小鼠的运动轨迹仍均匀分布于社交应激旷场中,而应激组小鼠的运动轨迹主要分布于社交应激旷场中的右下角。

皮下肿瘤结节重量及体积变化的比较各组C57小鼠在皮下种瘤7天后,用千分尺测量小鼠皮下肿瘤的长径(b)和短径(a),根据公式V=b*a2/2,计算出皮下肿瘤的体积,并绘制体积变化曲线图(图4A)。C、F组小鼠皮下肿瘤体积的增长速度明显高于D组和E组；C组小鼠皮下肿瘤体积的增长速度与F组小鼠比较,差异明显；而D组与E组比较差异不大。运用多次重复测量资料的方差分析方法分析数据,球性检验结果不满足协方差矩阵球对称的条件(P＜0.01)。通过对一元分析结果进行校正,得出不同测量时相之间小鼠肿瘤体积存在差异(F=687.094,P＜0.01)的结论；不同测量时间和不同分组之间也存在着交互作用(F= 29.341,P＜0.01)。种瘤21天后,剖离皮下肿瘤结节,用电子天平称重,比较各种瘤组小鼠肿瘤结节的重量(图4B)。C组肿瘤结节的重量明显高于D、E和F组,差异有统计学意义(P＜0.05)；F组与E组和D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；E组与D组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。

血清中VEGF的表达水平C、F组血清中VEGF蛋白的表达明显高于其他各组,差异有统计学意义(P＜0.05)；D、E组血清中VEGF蛋白的表达明显高于A、B组,差异有统计学意义(P＜0.05)；D组与E组比较,血清中VEGF蛋白的表达差异无统计学意义(P＞0.05)；C组与F组比较,血清中VEGF蛋白的表达稍高,但差异无统计学意义(P＞0.05,图5)。

VEGFR2和L1CAM的mRNA表达水平C组C57小鼠肺组织中VEGFR2和L1CAM的m RNA表达水平明显高于其他各组,差异有统计学意义(P＜0.05,图6)。F组C57小鼠肺组织中VEGFR2和L1CAM的m RNA表达水平与A、B、D、E组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。D组小鼠肺组织中VEGFR2mRNA表达水平明显高于E组,差异有统计学意义(P＜0.05),E组肺组织中VEGFR2mRNA表达水平与A、B组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。D、E组肺组织中L1CAM mRNA表达水平明显高于A、B组,差异有统计学意义(P＜0.05),而B组与A组、D组与E组比较差异,无统计学意义(P＞0.05)。

肺组织中pErk、MMp-2及MMp-9蛋白的表达水平C、F组小鼠肺组织中p Erk、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均高于其他各组,差异有统计学意义(图7,P＜0.05)。D组小鼠肺组织中pErk、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平高于A、B组,差异有统计学意义(P＜0.05)；而E组与D组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。

讨 论

世界卫生组织2011年9月公布的最新数据显示,肺癌的发病率和死亡率在全球高居榜首,肺癌已经成为一个严重的公共健康问题［13］。尽管现代医学在肿瘤的治疗上已经取得了很大的进步,但是即使运用先进的分子靶向治疗技术,非小细胞肺癌患者的生存率仍然没有得到很好的改善［14］。肿瘤疾病的一个显著特点是易复发和转移［15］,肿瘤致死的患者中超过90%死于肿瘤的复发和转移,而非原发性肿瘤疾病本身［16］。

抑郁症(major depression disorder,MDD)或称抑郁障碍,是由各种原因引起的以抑郁为主要症状并伴有相应思维与行为改变的一组心境障碍［17］,它严重地影响了人们的工作和生活质量,而其具体的病因及发病机制目前尚不完全清楚。国内已有研究证明高神经质、内倾、高社会依赖性、自律自责性、完美主义人格特质及负性生活事件为MDD的高危易感因素［18］。据世界卫生组织(WHO)预测,到2020年MDD将成为仅次于缺血性心脏病的第2位致残疾病［19］。MDD的发病多由亲人死亡、夫妻离异、天灾人祸等负性生活事件造成,临床表现为情绪抑郁、多愁善感、思维迟钝、睡眠障碍,学习工作效率低下、多疑、缺乏生活情趣,甚至有自杀倾向［20］。社交应激性抑郁动物模型模拟人类社交失败时呈现的心理状态,多次给予实验动物社交失败应激刺激,使实验动物产生与人类抑郁症状相似的抑郁样行为学改变,从而为研究人类MDD提供模型基础。

研究证实,肿瘤患者特别是进展期或晚期肿瘤患者常伴发心理性疾病,尤其是MDD［21］。MDD不仅会降低肿瘤患者的生活质量,造成身心痛苦,使他们渴望死亡或自杀,甚至还会引起患者家属的心理性疾病［22］。因此,为了提高肿瘤患者的治愈率、改善肿瘤患者的生活质量和心理状态,有必要对肿瘤伴发抑郁的疾病状态进行研究,观察社会心理因素引起的抑郁状态对肿瘤生长的影响,从而为肿瘤伴发心理性疾病的治疗提供一定的实验依据。

由于肿瘤患者在肿瘤发病的任何阶段都有可能伴发心理性疾病,因此本实验通过设置肿瘤发病前、发病中和发病后3个不同干预时段,观察社交应激性抑郁对小鼠肿瘤生长的影响。实验中将小鼠的社交应激模型与肺癌模型在不同时段相结合,分别在社交应激模型建立的10天时间里,选取3个时间点给予实验小鼠皮下种瘤,观察不同时段的社交应激对小鼠肺癌进展的影响。从实验结果可以发现(如图4),在实验小鼠皮下种瘤之前,先给予小鼠应激刺激,会对实验小鼠的机体即肿瘤的生长环境产生影响,而且应激对小鼠机体的影响有利于皮下肿瘤的生长。肿瘤的生长依赖于其自身血管形成和发展,VEGF是与血管生成有关的重要的特异性细胞因子［23］,VEGF通过与VEGFR结合激活细胞内一系列蛋白,使其发生二聚化和自身磷酸化而发挥生物学效应。此外, VEGF还可诱导血管内皮细胞的增殖、出芽及微血管形成［24］。因此,我们检测了小鼠血清中VEGF蛋白的表达水平及转移的肺组织中VEGFR2mRNA的表达水平。通过对各组实验结果的比较(图5、6),我们推测瘤前应激组在经过10天社交应激之后,小鼠机体免疫力已经有所下降,在此基础上接种肿瘤细胞,机体对肿瘤细胞的免疫力不足,加上应激可能对VEGF及VEGFR的生成有一定作用,因此该组小鼠皮下肿瘤的生长速度最快。因为急性应激可以激活并增强机体的免疫防御能力,所以对于瘤后应激组,在接种肿瘤的基础上紧接着给予社交应激刺激,这一刺激很可能增强了小鼠免疫系统对肿瘤细胞的免疫防御作用,相比其他各组,该组小鼠的肿瘤生长相关指标的表达水平最低。

肿瘤的生长和转移是一个长期、多步骤的过程,其中最重要的一步就是对由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白以及结缔组织的蛋白聚糖等高分子化合物组成的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解,ECM可以被多种蛋白酶所降解,其中MMPs家族中的明胶酶类MMP-2和MMP-9是参与肿瘤细胞降解ECM、发生侵袭和转移的主要酶类［25］。既往研究发现,肿瘤的始发和进展往往与细胞黏附分子表达水平的变化有关,这一变化可以通过增强细胞迁移的信号传导来刺激肿瘤细胞转移［26］。近期研究显示,L1CAM过表达与肺癌、黑色素瘤等肿瘤的预后和转移密切相关,L1CAM还与其他类型肿瘤的淋巴结和骨髓的微小转移有关,这说明L1CAM在肿瘤的早期转移扩散中发挥着重要作用。本实验检测了小鼠肺组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平以及L1CAM mRNA的表达水平,其结果与VEGF及VEGFR所反映的结果基本相符,瘤前应激组血管生长相关分子的表达水平均高于其他各组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

本研究发现肿瘤发生前期所伴发的抑郁状态对肿瘤生长有促进作用。这一发现提示临床医师,在肿瘤伴抑郁状态的患者接受抗肿瘤治疗的同时给予抗抑郁药物,有利于改善患者的抑郁状态。推测社交应激对肿瘤生长的影响不仅作用于肿瘤生长相关的细胞因子的表达,还会对机体的免疫系统产生影响,但是社交应激对免疫系统的影响程度、作用的时间点及通路等问题,还有待进一步探讨和研究。

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Effect of social stress in different time periods on the growth of lung cancer in mice

WU Xiao,LIU Bao-jun,WU Jin-feng,LI Bei,GONG Wei-yi, XU Hai-lin,DUAN Xiao-hong,DONG Jing-cheng△
(Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Huashan Hospital, Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To observe the effect of social stress in different time periods on the growth of lung cancer in mice.MethodsThirty-six C57BL/6J mice were randomly and equally divided into group A(normal control),group B(depression group),group C(tumor before social stress group), group D(tumor group),group E(tumor after social stress group),and group F(5 daysˊsocial stress before tumor then another 5 daysˊsocial stress).On the basis of 10 daysˊsocial stress modeling,just before,during and after the social stress,we inoculated the lung cancer cells subcutaneously in C,D and E group.ELISA was used to measure the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in the serum,while Western blot was used to measure the amount of phosphorylated extracellular regulated protein kinases(p ERK),matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9).Real-time PCR was used to measure the amount of VEGF receptor 2(VEGFR2)mRNA%and L1 cell adhesion molecule(L1CAM).ResultsThe weight and volume of tumor nodules,as well as the expression of the above cytokines that related with tumor growth and metastasis in group C and F were much more higher than any other groups(P＜0.05).On the other hand,there was no significant difference on the weight or volume of tumor nodules,or the expression of the cytokines between group D and E(P＞0.05).ConclusionsSocial stress that occurred before and among the process of lung cancer in mice has significant effect on the growth of lung cancer,while the inner mechanism needs further research.

social stress； tumor growth； psychosocial factors； cytokines

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.002

2013-02-16；编辑：张秀峰)

国家重点基础研究发展计划(973计划,2009CB523001)；国家自然科学基金(81173390,81102562)；国家教育部博士点科研基金(20110071120072)

△Corresponding author E-mail：jcdong2004@126.com

*This work was supported by the National Key Basic Research program of China(973 program,2009CB523000),National Natural Science Foundation of China(81173390,81102562),Chinese Ministry of Education Fund for Doctor Discipline Scientific Research (20110071120072).