副溶血弧菌的致病性及检测方法

张金金扈庆华李连青

·综述·

副溶血弧菌的致病性及检测方法

张金金1扈庆华2李连青3★

副溶血弧菌是沿海地区的一种嗜盐性细菌，其生长快，繁殖速度高，常通过感染多种海产品而引发人的食物中毒发生，近年来，由副溶血弧菌引起的食源性疾病日益增多，到目前为止，O3：K6型副溶血弧菌菌株已引起了亚洲、欧洲、美洲、非洲等多个国家的大流行。随着由副溶血弧菌引起疾病的规模不断增加和频发，人们对其也更加关注，各种检测方法逐渐取代传统的生化鉴定实验，尤其是在食品微生物检测、流行病学调查以及医院感染监控等方面发挥越来越重要的作用。本文就副溶血弧菌的基础特性，致病性及目前的检测方法作一综述。

副溶血弧菌；血清型；致病性；毒力；快速检测

副溶血弧菌是我国沿海地区食源性暴发疾病中最常见的一种病原菌，近几年随着海鲜类食品在市场的广泛流通，副溶血弧菌所引发的食物中毒的发生率也逐渐增多。从我国食源性疾病监控网络数据显示，由副溶血弧菌引起的食物中毒呈显著上升趋势，在某些沿海省市由该菌引发的食物中毒比例高达60％以上，其引起的食物中毒案例甚至在数量上数次超过沙门氏菌中毒案例，成为我国的首要食源性致病菌［1_2］。

1 副溶血弧菌的基础特性

1．1副溶血弧菌的分布地位和临床特征

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）属于弧菌科弧菌属，革兰氏阴性菌。此菌广泛分布于海岸和海水中，海产品是其感染的主要对象，被该菌感染的蟹、贝壳、虾等水产品多次引起胃肠炎爆发，临床上以急性起病腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，严重者可出现全身痉挛甚至急性肾功能衰竭［3］。尤以日本、东南亚、美国及我国台湾地区多见［4］，也是我国沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。

1．2副溶血弧菌的形态及培养特性

副溶血弧菌一般为球状杆菌，其菌体为弧状、杆状或丝状，无芽胞，无荚膜，有鞭毛。菌落中等大小，在绵羊血平板上不溶血，在弧菌TCBS培养基上生长，菌落呈蓝绿色透明状。在SS琼脂平板上为圆形、扁平、边缘整齐、光滑湿润、蜡滴样的粘韧性菌落。其主要生化特性为嗜盐，在无盐的培养基上不生长，在3％～6％盐度中生长较好。

1．3副溶血弧菌的流行病学调查

副溶血弧菌是1953年日本学者Fujino在一个食物中毒患者体内初次分离得到的。在1995年前，日本境内检出率最高的副溶血弧菌血清型为O4：K8。1996年，一种新的血清型为O3：K6、tdh阳性、trh阴性的副溶血弧菌克隆群引起的暴发在印度Calcutta发生，经此次事件最终分离得到了新的菌株，而在此之前，在Calcutta从未分离到过O3：K6型菌株。随后，在日本，台湾等地由副溶血弧菌引起的疾病事件的数量及比例急剧增加。在1996_1998年间，由副溶血弧菌引起的食物中毒的案例在日本就达两万多件。尤其近年由VP引起的食物中毒占细菌性食物中毒的40％～60％，居首位。在我国台湾，O3：K6型菌株最早于1995年发现，当时仅占副溶血弧菌感染总数的不到1％，而在第二年年突然升高到50％以上［5］。到目前为止，这一克隆群已引起了亚洲、欧洲、美洲、非洲等多个国家的大流行。

1．4副溶血弧菌的血清型

日本的研究者以菌体脂多糖O抗原和英膜K抗原为基础，开发了副溶血弧菌的血清型鉴定系统。通过对细菌进行血清分型可对不同地区不同来源菌株进行比较，对菌群流行的长期趋势进行描述，为流行病学调查和临床用药提供依据。VP的血清型有75种，分别由13种不同的O抗原和71种不同的K抗原组成［6］。

Nair等［7］通过研究进一步提出“血清型变异”假说，即O4：K68、O1：K25和O1：KUT等其他血清型菌株可能是由同一株O3：K6菌株O、K抗原变异而来，这些菌株构成了现在流行的O3：K6菌群。而这类其他血清型的菌株常被人们称为O3：K6型菌株的衍生物。P．S．MarieYeung用不同的分子分型检测方法（EcoRI核糖分型、NotI PFGE分型和tdh测序）测得O4：K68和O1：KUT型菌株与O3：K6型菌株有着相似的核糖分型图谱、PFGE图谱和基因序列，证实其与O3：K6型菌株有着很近的亲缘关系，因此，对这两种血清型的菌株应该多加重视。目前采用多种分子分型技术鉴定发现已有21种血清型的菌株和O3：K6型菌株关系密切相关。

1．5副溶血弧菌的分子生物学特性

多数学者认为VP菌株含有两环状染色体［8］，分别是大染色体和小染色体，KP阳性和阴性菌株主要区别在大染色体的基因序列。与霍乱弧菌比较发现，两者的大染色体结构相似，而小染色体结构则有很大不同，这主要与位于小染色体上的TDH基因编码区有关。关于副溶血弧菌的质粒研究，国内外均有报道，VP菌株有两种质粒：分子质量为55MD的隐蔽质粒和分子质量为pSA55的R质粒。其中前者无抗药性，后者可介导对多种抗生素的耐药性。另外在副溶血弧菌菌株中也存在两种鞭毛：周鞭毛和极性鞭毛。前者主要在粘性环境多见，后者常表达于非粘性的液体等环境中。

2 副溶血弧菌的致病性及检测方法

2．1致病性与致病机制

副溶血弧菌是重要的人类肠道病原，常由食入不卫生的或半生的水产品引起。该菌也是养殖水产动物的重要条件性病原。副溶血弧菌也是中国对虾（Penaeus chinensis）的病原菌，可引起对虾红腿病。副溶血弧菌还能感染蟹类与贝类，导致蟹类及贝类的大量死亡［9］。此外，副溶血弧菌对网箱大黄鱼的致病性己有较多的报道，主要引起体表充血及肠炎等症状，在天气炎热季节多发生。副溶血弧菌引起的疾病一般表现为发病急，临床症状较重，但其致死率不高。一般4～6月和8～10月两个汛期为发病高峰，各年龄段都可发病。副溶血弧菌肠炎是最常见的肠道感染性疾病，恢复较快，病程2～3天，通常为自限性，大部分呈良性经过。

研究发现副溶血弧菌的致病机制主要包括：（1）粘附：Nakasone，Nagayama研究发现其粘附作用发生主要与纤毛以及细胞血凝素有关。（2）侵袭：体内外研究发现，VP普遍对肠上皮细胞容易发生侵袭。（3）Ⅲ型分泌系统TTSS：Makino研究表明TTSS2基因簇与VP的致病性密切相关，而TTSS1基因簇普遍存在于VP菌株中，但致病性目前尚不清楚。（4）摄铁系统：VP的铁载体即弧菌铁素可以与血红素的铁螯合从而转运到细胞内，满足一些致病性细菌的生长繁殖需要。

2．2毒力因子

大部分副溶血菌株并不致病，只有少部分菌株才有致病力。神奈川现象（Kanagawa phenomenon，KP）是鉴定致病性与非致病性菌株的重要指标之一［8，10］，该现象表现为：一些致病性菌株能在含7％氯化钠的人O型血或兔血莪妻氏平板上产生β溶血。大量的流行病学调查表明，部分临床株（超过90％）为TDH阳性，小部分环境株（1％～2％）为TDH阳性，而KP现象的必要且充分条件为产菌株TDH。因此KP现象长期以来都作为判断菌株是否有致病性的一个重要指标。

2．2．1耐热直接溶血素（TDH）

TDH为二聚体蛋白，富含天门冬酸和缬氨酸，由2个氨基酸肽链构成。TDH对热耐受，具有多种生物学活性如溶血活性、细胞毒和致死作用等。TDH对马红细胞不敏感，能溶解人、兔、狗和小白鼠的红细胞，在莪氏血平板上产生β_溶血，即神奈川现象（KP）。由于KP的假阳性出现，TDH逐渐替代KP成为判定VP致病力的新证据。此外TDH还具有肠毒素活性，由胞内钙离子介导的肠液累积效应引起，可导致肠液积聚和肠道氯化物的分泌。由于其是一种成孔毒素，在细胞膜上形成通道，导致膜被穿透破坏以及胞内溶胶的渗透而裂解，可对多种细胞有细胞毒性作用。另外TDH的保守序列还可以作为PCR监测的目标基因［11］。

2．2．2耐热直接溶血相关毒素（TRH）

TRH也是副溶血弧菌的一个重要毒力因子，是Nishibuchi从KP阴性的腹泻病人临床分离株中发现的。其生物学特性与TDH相同，具有溶血和肠毒素作用，但不耐热，对牛、羊、鸡的红细胞溶血性高，对马则无溶血性。临床分离的副溶血弧菌菌株少数携trh基因，可能同时含有tdh和trh基因序列，而绝大多数的环境分离株既无tdh序列也无trh序列。利用基因探针技术发现极少数KP+阳性株也含有trh基因，并检测到能同时分泌2种毒素。编码TRH的基因据其核酸序列的变化可分为两个亚组：trh1和trh2基因，两者同源性为84％。不同副溶血弧菌菌株的trh1和trh2序列有明显差异，trh1基因的表达水平高于trh2基因。研究还表明trh基因和tdh基因的同源性达68％，两者免疫原型相似，抗原性有部分交叉。另外，trh基因与镍转运系统操纵子、尿素酶基因ure紧密连锁，均位于小染色体上。

2．2．3不耐热溶血毒素（TLH）

TLH是一种非典型的磷脂酶，在卵磷脂存在的条件下对人、马的红细胞均比较敏感，也可以溶解绵羊红细胞，具有种属特异性，李志峰等［12］人对其基因分析结果显示，TLH作为特异性标志物对VP分子诊断、监测方面具有较高的应用价值。

2．2．4胞外酶及其他因子

最近几年随着研究深入，一些胞外蛋白酶［13］也逐渐被人们发现，Lee研究了来源于临床分离株的93号副溶血弧菌，发现丝氨酸蛋白酶（PKA）具有潜在的毒力作用。在tdh和trh基因缺乏的条件下，它可以使得红细胞发生溶解，具有一定的溶血作用但对热敏感。另外一些胃肠炎由KP阴性、尿素酶阳性的副溶血弧菌菌株引起。有学者纯化了临床株分泌的尿素酶后，发现其能引起乳鼠回肠段肠液滞留，从而表明尿素酶是副溶血弧菌另一重要致病因子。其作用可能是当细菌入侵胃部后，尿素酶中和胃酸，进而增加了胃壁细胞的通透性。

近年研究发现尿素酶阳性菌株与trh基因携带呈正相关。Okuda调查了1979～1985年美国西海岸分离的VP菌株，发现60株ureC阳性菌株98％携带trh基因，而25株ureC阴性菌株全部不携带trh基因，而之后在泰国分离的菌株也证实了相似的结果。由此推测尿素酶与trh基因具有相关性。还有一些研究认为尿素酶基因与溶血素的表达也有联系，并推测尿素酶基因抑制了溶血素的表达，因为同时携带tdh和trh基因的菌株很少携带尿素酶基因，而携带尿素酶基因的菌株往往tdh表达量很低。但也有学者研究后认为尿素酶基因并不会影响trh或tdh基因的表达［14］。

许多研究证实副溶血弧菌具有一定侵袭性［15］。在体外研究中发现部分Vp菌株对培养的细胞具有侵袭作用，Akeda对21株副溶血弧菌的研究证明，有4株菌株可对Caco-2细胞产生一定侵袭性，而其中一株Vp分离株AQ4023的侵袭力可以被一些药物所抑制，表明酪氨酸蛋白激酶介导的信号转导过程、鞭毛结构和细胞骨架成分可能在侵袭发生的过程中发挥一定作用。

2．3检测方法

2．3．1传统培养及鉴定

我们常规分离到的副溶血弧菌主要形态、培养及生化特性来鉴定，目前主要参照国家标准GB／T 4789．7～2003方法进行，并采用日本生研株式会社生产的诊断血清进行菌株的分型鉴定。通过美国食品药品管理局制定的FDA细菌分析手册中的最大可能数方法即MPN方法进行广泛的定量检测。该方法准确性高，但周期长，操作复杂，耗费人力，不适宜VP菌的快速大量检测。

2．3．2噬菌体裂解法检测

噬菌体对副溶血弧菌具有种特异性，可使95％以上的细菌发生裂解，且周期可缩短至两天，是副溶血弧菌快速检测及流行病学调查中的一种有效手段。

2．3．3免疫学方法鉴定

该技术已有多半个世纪的历史，具有特异性强、灵敏度高、易于观察，无需分离直接检测等优点。目前常用的有酶免疫技术如间接ELISA、双抗体ELISA技术，免疫荧光技术和胶体金技术。有研究报道，副溶血弧菌在不良环境下，可进入“活的非可培养状态”即VNC状态，在此状态下的细菌仍具有致病力，但常规方法无法检测，容易造成漏检，因而可以通过免疫学方法进行检测。但此方法容易因为VP菌抗原多而出现假阳性或假阴性。

2．3．4基因快速检测

随着分子生物学的发展，基因检测方法已经表现出越来越大的优越性，目前国内外学者已经建立了多种针对溶血毒素的基因探针［16］如TDH探针、TRH探针、TLH探针、toxR、gyrB等等。而PCR技术凭借其敏感、快速、稳定、特异性强、操作简单等优点越来越广泛的应用于微生物的鉴定及检测方面［3，17］。常见的PCR检测技术［18_20］有：单一PCR、多重PCR技术、实时PCR技术［19］、纳米PCR技术。另外其他一些快速检测技术如通用引物PCR和单链构型多态性相结合的UPPCR-SSCP技术、DNA杂交法［21］、LAMP检测方法、VP快速测试片、电化学及电子鼻技术、基因芯片技术也越来越多的应用于日常检测中。但是单纯的每一种方法并不是绝对完美的，其仍存在很多不足，如有些方法只适合某一种基因型的使用，对其他基因型则不一定有效，因此我们应进行多种方法的联合应用，尽量开发可直接在食物中快速检测的方法从而简化分离操作过程。

3 结语

副溶血弧菌的致病性常由多因素作用而致，各因素之间的交互作用非常复杂，有待进一步更深入的研究发现，随着分子生物学的快速发展，其检测方法也将越来越多样化，越来越快捷，灵敏，特异，未来我们应更多地研究一些在快速，准确的定性定量方面都得以兼顾的方法，使其更好地服务于社会。

[1]Chao G X,Jiao X,Zhou X H,et al．Distribution, prevalence,molecular typing and virulence of Vibrio parahaemolyticusisolatedfromdifferentsourcesin coastal province Jiangsu,China[J]．Food Control,2009, 20(10):907_912．

[2]Zhang J Q,Luo X H,He S Y,et al．Monitoring and research of infectious diarrhea in Vibrio parahaemolyticus[J]．Chin Health Lab Technol,2010,20(2):376_378．

[3]Erika Harth-Chu,Romilio T,Espejo．Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis for Clonal Identification of Vibrio parahaemolyticus Isolates by Using Cap illary Electrophoresis[J]．2009:4079_4088．

[4]Yan Y F,Cui Y J，Han H H，et al．Extended MLST-based population genetics and phylogeny of Vibrio parahaemolyticus with high levels of recombination[J]．International Journal of Food Microbiology,2011,145: 106_112．

[5]Chang H C,Chen M L．Molecular characterizations of pathogenicVibrioparahaemolyticusisolatedfromSouthern Taiwan oyster-growing environment[J]．Food Control,2011,22(2):245_251．

[6]Harth E,Matsuda L,Hemandez C．Epidemiology of Vibrio parahaemolyticus outbrea ks,southern Chile[J]．Emerg Infect Dis,2009,15(2):163_168．

[7]Suthienkul O,Ishibashi M,Iida T,et al．Urease production correlates with possession of the trh gene in Vibrio Parahaemolyticus strains isolated in Thailand[J]．Infect Dis,1995,172(5):1405_1408．

[8]Yang F,Li X J,Xu B H,et al．Advances of study on moleculepathogenicmechanismofVibrioparahaemolyticus[J]．Chin Dis Control Prev,2010,14(6): 562_566．

[9]Greig J D,Ravel A．Analysis of foodborne outbreak data reported internationally for source attribution[J]．Int J Food Microbiol,2009,130(2):77_87．

[10]Boyd E F,Cohenl A L V,Naughton L M,et al．Molecularanalysisoftheemergenceofpandemic Vibrio parahaemolyticus[J]．BMC Microbiol,2008,8: 110_123．

［11］Rykovskaia O A,Shalu O A,Monakhova E V,et al．The development of complex technique of evaluation of virulence of parahemolytic vibrio[J]．Klin Lab Diagn, 2013,(2):38_41．

［12］李志峰,聂军,陈义忠．一种快速检测副溶血弧菌的PCR方法[J]．解放军预防医学杂志,2004,22(6)．

［13］Lee C Y,Hong Y,Ryu J,et al．Detection and identification of Vibrio species using whole-cell protein pattern analysis[J]．Microbiol Biotechnol,2012,22(8): 1107_1112．

［14］Bon K,Yohko S,Hajime T．Multiple-locus variablenum ber of tandem-repeats analysis distinguishes Vibrio parahaemolyticus pandemic O3:K6 strains[J]．Journal of Microbiological Methods,2008,72(3):313_320．

[15]Xu J,Turner J W,Idso M,et al．In situ strain-level detection and identification of Vibrio parahaemolyticus using surface-enhanced Raman spectroscopy[J]．Anal Chem,2013,85(5):2630_2637．

[16]Wataru Y,Yuko U,Naoaki M,et al．Development of a Loop-MediatedlsothermalAssayforSensitiveand Rapid Detection of the tdh and trh Genes of Vibrio parahaemolyticus and Related Vibrio Species[J]．Applied and Environmental Microbiology,2010,76(3):820_828．

[17]Raghunath P,Karunasagar I,Karunasagar I．Improved isolationanddetectionofpathogenicVibrioparahaemolyticus from seafood using a new enrichment broth[J]．Int Food Microbiol,2009,129(2):200_203．

[18]Rosec J P,Simon M,Causse V,et al．Detection of totalandpathogenicVibrioparahaemolyticusin shellfish:comparison of PCR protocols using Pr72H or toxR targets with a culture method[J]．Int Food Microbiol,2009,129(2):136_145．

[19]Tyagi A,Saravanan V,Karunasagar I,et al．Detection of Vibrio parahaemolyticus in tropical shellfish by SYBR green real-time PCR and evaluation of three enrichment media[J]．International Journal of Food Microbiology,2009,129(2):124_130．

[20]Bhattacharyya N,Hou A．A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticusisolates[J]．Lett Appl Microbiol, 2013,57(3):233_240．

[21]Ribeiro R L,Machry L J,Brazil M V．Technical improvement to prevent DNA degradation of Leptospira spp In pulsedeld gel electrophoresis[J]．Letters in Applied Microbiology,2009,49(2):289_291．

The pathogenicity and detection methods of Vibrio parahaemolyticus

ZHANG Jinjin1，HU Qinghua2，LI Lianqing3★
（1．Futian District Center for Disease Prevention and Control，Guangdong，Shenzhen 518040，China；2．Shenzhen Center for Disease Control and Prevention，Guangdong，Shenzhen 518055，China；3．Shanxi Center for Clinical Laboratories，Shanxi，Taiyuan 030012，China）

Vibrio parahaemolyticus is a kind of halophilic bacteria in the costal waters．It has fast growth，and high reproduction rate．Vibrio parahaemolyticus can cause food intoxication of people by infected with a variety of seafood．In recent years，foodborne diseases caused by vibrio parahaemolyticus is increasing．So far，O3：K6 type vibrio parahaemolyticus strains has caused a pandemic popular in Asia，Europe，America，Africa and other countries．As the increasing size of diseases caused by vibrio parahaemolyticus，people also pay more attention to it．All kinds of detection methods play a more and more important role in food microbe testing，epidemiological investigation and hospital infection controlling instead of the traditional biochemical identification experiment．This article summarized．the basic features，pathogenicity and detection methods of vibrio parahaemolyticus．

Vibrio parahaemolyticus；Serotype；Pathogenicity；Virulence；Rapid detection

国家科技重大专项（2012ZX10004215）

1．深圳市福田区疾病预防控制中心，广东，深圳518040 2．深圳市疾病预防控制中心，广东，深圳518055 3．山西省临床检验中心，山西，太原030012

★通讯作者：李连青，E-mail：sxllq＠tom．com