养阴活血合剂对自发性高血压大鼠的肾保护作用及其相关机制研究

周婷 屈长宏 蒋红心 廖建春 茆俊卿 刘晓静 黄萍

（扬州市中医院，江苏扬州 225002）

养阴活血合剂对自发性高血压大鼠的肾保护作用及其相关机制研究

周婷 屈长宏 蒋红心 廖建春 茆俊卿 刘晓静 黄萍

（扬州市中医院，江苏扬州 225002）

目的：观察中药养阴活血合剂对自发性高血压大鼠（SHR）肾损害的保护作用及其可能机制。方法：将20只12周龄的雄性SHR大鼠随机分为SHR组、中药组、安博维组和联合组，每组5只，同时设5只同龄Wistar-Kyoto（WKY）大鼠作为正常对照组。中药组和安博维组分别予养阴活血合剂（等效剂量为每日15g/kg）和安博维（等效剂量为每日30mg/kg）灌胃，每日1次；联合组则给予养阴活血合剂加安博维灌胃，每日1次；SHR组和正常对照组均给予等量的蒸馏水每日1次灌胃。共治疗及喂养8周，监测尾动脉血压。在实验开始给药前及实验结束后留取小便标本及血标本，检测尿β2-微球蛋白（β2-MG）和尿微量白蛋白（mALB）及血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA和内皮素1（ET-1）mRNA的表达。结果：实验前SHR各组血压均显著高于WKY组；实验后与实验前相比，中药组、安博维组和联合组大鼠血压均明显下降。实验后SHR组大鼠尿mALB、β2-MG较实验前明显升高，中药组、安博维组则明显下降，联合组下降更明显。实验后中药组、安博维组及联合组大鼠尿mALB、β2-MG均明显低于SHR组。与SHR组相比，中药组、安博维组、联合组肾组织TGF-β1和ET-1 mRNA的表达均显著下降。结论：养阴活血合剂可降低SHR大鼠血压，降低尿微量蛋白，其肾保护作用机制可能与其下调肾组织TGF-β1mRNA和ET-1mRNA表达的功能有关。

养阴活血合剂 自发性高血压 转化生长因子β1内皮素-1 实验研究

近年来，随着高血压的发病率逐渐增高，对于高血压引起的肾损害越来越受到人们的重视。现已发现高血压早期肾脏就已出现了异常改变，因此对于高血压引起的肾损害的早期诊断和早期治疗就显得颇为重要。我们前期研究发现，养阴活血合剂对高血压早期肾损害患者具有显著的疗效，本实验进一步研究养阴活血合剂对自发性高血压大鼠早期肾损害的保护作用及其相关机制。

1 实验材料

1.1 实验动物自发性高血压大鼠（SHR）20只，Wistar-Kyoto（WKY）大鼠5只，SPF级，雄性，12周龄，平均体重（280±20）g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 药物养阴活血合剂由熟地黄15g、山茱萸15g、何首乌15g、枸杞子15g、丹参15g、川芎10g、水蛭10g、川牛膝10g、泽兰10g、天麻10g、钩藤10g、丹皮10g组成，由扬州市中医院制剂室煎制，煎制成浓度1.5g/mL的药液。安博维（厄贝沙坦），150mg/片，杭州赛诺菲安万民生制药有限公司生产。

1.3 试剂与仪器Trizilo试剂、逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）；PCR试剂和TaqDNA聚合酶（美国Fermentas公司）；琼脂糖凝胶（英国OSOID公司）；DNA Marker（美国Fermentas公司）；10mg/mL溴化乙锭（美国Sigma公司）；美国ABI17900实时定量PCR仪；DSWY-1大鼠尾动脉血压测量装置（上海欣曼科教设备有限公司）；RM6240生物信号采集系统（成都仪器厂）；全自动生化分析仪（西班牙DIAGNOSTIC）；低速离心机（日立7060型，日本日立公司）；超低温冰箱（SANYOMDF-U71V型，日本）。

2 实验方法

2.1 分组与给药25只大鼠予普通饲料适应性喂养1周，将20只SHR大鼠随机分为SHR组、中药组、安博维组和联合组，每组5只，另取5只同龄WKY大鼠作为正常对照组。中药组予以养阴活血合剂灌胃，每日1次，根据大鼠与人的体表面积比例，按人每公斤体重的临床日用量折算大鼠的等效剂量，大鼠中药等效剂量为15g/（kg·d）。安博维组给予安博维灌胃，每日1次，安博维的等效剂量为30mg/（kg·d）。联合组则给予养阴活血合剂加安博维灌胃，每日1次。正常对照组和SHR组均给予等量蒸馏水每日1次灌胃。各组均治疗并喂养8周。

2.2 血压测量测量大鼠尾动脉血压，实验前测1次，实验后第1、2周各测血压1次，以后每隔2周测血压并记录，直至实验结束。每记录1次测血压3次，取均值。

2.3 生化指标检测在实验开始给药前及实验结束前1天清晨留取小便标本，采用放射免疫法检测尿β2-微球蛋白（β2-MG）和尿微量白蛋白（mALB）含量。在实验前及实验结束时留取血标本1mL，用以检测血尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）。

2.4检测大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA和内皮素1（ET-1）mRNA的表达采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR）技术进行检测。断头处死大鼠后，迅速取肾脏，Trizol试剂提取总RNA，然后进行逆转录和PCR反应。内参照引物（Gapdh）上游引物：ACTTTGGCATCGTGGAAGGG，下游引物：ACTTGGCAGGTTTCTCCAGG；TGF-β1上游引物：AGGGCTACCATGCCAACTTC，下游引物：CCACGTAGTAG ACGATGGGC；ET-1上游引物：ATCAGAGCAACCAGACA CCG，下游引物：TGCACTTCCTTCTCAGCTCG。PCR反应体系25μL，含2μL DNA模板，上游引物及下游引物（10μmol/μL）各1μL，12.5μL SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ，8.5μL灭菌蒸馏水。PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃5s、60℃30s，40个循环。每个循环延伸结束检测荧光信号。随后是一个缓慢升温的程序，同时连续检测DNA产物的溶解曲线，以了解样品扩增的特异性，保障测定结果的准确可靠。然后用2-ΔΔCt法进行分析，相对表达量＝2-ΔΔCt。

2.5 统计学方法采用SPSS13.0软件进行统计分析，正态分布计量数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠实验前后尾动脉血压比较实验前SHR大鼠各组血压差异无统计学意义，但均显著高于正常对照组。实验后与实验前相比，中药组大鼠血压显著下降（P＜0.05），安博维组和联合组下降更显著（P＜0.001），提示中药养阴活血合剂有一定的降压作用。见表1。

3.2 各组大鼠实验前后肾功能比较实验前后各组大鼠BUN、Scr含量比较均无明显差异（P＞0.05）。实验后SHR组mALB、β2-MG较实验前明显升高（P＜0.01），中药组、安博维组则明显下降（P＜0.05），联合组下降更明显（P＜0.01）；实验后中药组、安博维组及联合组尿mALB、β2-MG明显低于SHR组（P＜0.01）。见表2。

3.3 各组大鼠实验后肾组织TGF-β1和ET-1 mRNA表达比较与SHR组相比，中药组、安博维组、联合组大鼠肾组织TGF-β1和ET-1 mRNA的表达均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

4 讨论

高血压病肾脏损害的病理表现主要为肾小动脉硬化，入球小动脉、小叶间动脉玻璃样变性和间质纤维化，其中肾间质纤维化是高血压病肾脏损害的重要病理基础。转化生长因子β1（TGF-β1）在肾间质纤维化过程中起到重要的作用。TGF-β1可促进ECM蛋白的生成和沉积，降低蛋白酶的生成而减少基质降解[1]，可促进肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞肥大；使肾小管上皮细胞发生表型转化，成为肌成纤维细胞；促进细胞凋亡，导致肾小管萎缩、肾功能损害[2]。王甜等[3]研究发现，SHR大鼠肾脏组织TGF-β的表达随周龄和血压的增加而升高，与β2-MG的变化趋势一致，可以作为早期肾损害的诊断指标。ET-1是参与了高血压肾损害的另外一种重要的因子，是血管强力收缩剂，可显著减少肾脏血流量（RBF）和肾小球滤过率（GFR）。ET-1还可促使肾脏血管平滑肌细胞的增生，肾小球系膜细胞生长，促进肾小球硬化的形成与发展，加重高血压时肾功能损害的程度。有研究发现，16个月龄的自发性高血压大鼠存在明显的肾损害，血浆和肾组织中的ET含量也明显升高，提示ET可能参与了SHR的肾损害[4]。

高血压早期肾损害阶段，肾脏没有明显的结构和功能改变，缺少相关的临床症状和体征，尿素氮和肌酐在早期不能反映肾小球的滤过功能，用常规的检测方法难以较早判断肾脏损害情况。而尿mALB在肾小球轻度受损时即明显升高，标志着肾小球滤过膜电荷选择性屏障损伤，是肾小球早期损害的敏感指标。β2-MG是体内所有有核细胞的固有成分，几乎全部由肾小球滤过，99%被肾小管重吸收，是判断肾小管、肾间质损害的敏感指标。尿mALB和β2-MG联合检测可以早期发现肾脏损害。本实验证实，SHR大鼠在13周时即有尿mALB、和β2-MG的显著升高，且随着周龄的增加而升高（P＜0.01）。

中医认为高血压早期肾损害病位主要在肝肾两脏，以肝肾阴虚、肝阳上亢为主要病理基础，瘀血为主要病理因素。《内经·素问》云：“肾者主水，受五脏六腑之精而藏之”，“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也”。肾虚，封藏失司，不能固涩精微，致精微外泄；肝肾阴虚，脉道失濡，血行不畅，肾络瘀阻，且“久病必瘀”，瘀阻肾络，清浊不分，精微壅而外溢，皆可出现尿mALB、β2-MG升高等高血压早期肾损害的表现。据此理论，中医治疗立法以养阴活血为主，方中熟地黄、山茱萸、何首乌、枸杞子补肝肾，益精血，固涩精微；丹参、水蛭、川芎、丹皮、川牛膝活血化瘀通络，川牛膝又引药下行，丹皮兼清肝热；天麻、钩藤平息肝阳；泽兰活血利水。全方共奏养阴活血、固摄精微之功效。前期研究发现，养阴活血合剂可显著降低高血压合并早期肾损害患者的尿mALB、β2-MG和24h尿蛋白[5-6]。本研究通过养阴活血合剂治疗自发性高血压大鼠的实验发现，养阴活血合剂能降低SHR大鼠的血压，显著降低尿mALB和尿β2-MG，具有保护高血压肾脏损害的作用，安博维与养阴活血合剂合用则有协同作用。进一步研究发现，养阴活血合剂和安博维都可显著抑制SHR大鼠肾脏组织TGF-β1和ET-1 mRNA的表达，两者合用则作用更明显，显示养阴活血合剂可通过抑制肾组织TGF-β1和ET-1 mRNA的表达，进而抑制高血压引起的肾间质纤维化、肾小球硬化，从而起到肾保护的作用。

表1 各组大鼠实验前后尾动脉血压比较（±s）mmHg

表1 各组大鼠实验前后尾动脉血压比较（±s）mmHg

注：与本组0周时比较，△P＜0.05，△△△P＜0.001；与同时期SHR组比较，▲P＜0.05，▲▲▲P＜0.001。

组别动物数（只）0周8周正常对照组5108.6±8.050110.6±7.335 5177.2±11.17中药组5177.0±8.436154.4±6.044△▲安博维组5177.5±9.678118.0±11.76△△△▲▲▲联合组5174.8±8.402106.0±6.356△△△▲▲▲SHR组171.2±2.588

表2 各组大鼠实验前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比较（±s）

表2 各组大鼠实验前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比较（±s）

注：与本组实验前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与同时期SHR组比较，##P＜0.01。

组别动物数（只）正常对照组5 BUN（mmol/L）实验前实验后实验前6.2±1.5 6.5±2.852.6±8.1 68.2±7.1**54.8±7.386.4±5.9**中药组56.4±1.7 7.6±3.155.8±3.6 59.0±7.536.9±4.628.5±5.7*##56.1±6.243.2±9.3*##安博维组57.2±1.1 7.0±2.560.3±5.7 62.5±5.340.1±3.527.3±8.0*##52.7±5.839.5±8.7*##联合组56.7±2.6 7.4±1.658.9±7.2 63.8±6.139.5±4.315.4±5.6**##56.8±8.129.3±6.4**##实验前12.4±3.2 β2-MG（μg/L）实验前实验后5.9±2.46.3±3.1 6.8±3.0 8.5±2.453.5±5.4 67.2±2.138.7±5.2 Scr（μmol/L）实验后58.5±9.4 mALB（mg/L）实验后15.1±2.6 SHR组5

表3 各组TGF-β1和ET-1mRNA表达的变化（2-ΔΔCt）

[1]Schnaper H，Hayashida T，Hubchak SC，et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am JPhysiol Renal Physiol，2003，283（2）：243

[2]Li JH，Huang XR，Zhu HJ，et al.Role of TGF-beta signaling in extracellular matrix productionnunder high glucose conditions. Kidney Int，2003，63（6）：2010

[3]王甜，李静，时晔，等.转化生长因子β与结缔组织生长因子在自发性高血压大鼠肾脏的增龄性变化.陕西医学杂志，2012，41（8）：952

[4]王小丹，郑秋甫，谷庆阳，等.碱性成纤维细胞生长因子和内皮素在自发性高血压大鼠肾损害中的作用.解放军医学杂志，2000，25（4）：270

[5]周婷.中西药合用治疗高血压病早期肾损害疗效研究.辽宁中医杂志，2008，35（2）：256

[6]周婷，屈长宏.养阴活血方联合安博维治疗高血压病早期肾损害患者30例.中医杂志，2009，50（11）：1009

R544.105

A

1672-397X（2014）11-0077-03

周婷（1963-），女，本科学历，主任中医师，主要从事肾脏疾病的中西医结合诊治研究。Yzzt11757@163.com

2014-05-26

编辑：吴宁

江苏省中医药局科技项目（LZ11168）