滋肾清心汤对围绝经期大鼠卵巢bcl-2和bax表达影响的实验研究

雷雯 缪婷玉 陈赟 卢苏

（1.南京中医药大学，江苏南京 210023；2.江苏省中医院，江苏南京 210029）

滋肾清心汤对围绝经期大鼠卵巢bcl-2和bax表达影响的实验研究

雷雯1缪婷玉1陈赟2卢苏2

（1.南京中医药大学，江苏南京 210023；2.江苏省中医院，江苏南京 210029）

目的：研究中药滋肾清心汤对围绝经期大鼠卵巢bcl-2和bax蛋白表达的影响，探讨滋肾清心汤治疗围绝经期综合征可能的作用机制。方法：选用自然衰老的围绝经期雌性大鼠，随机分为4组（每组10只）：更年期大鼠模型组（模型组）和滋肾清心汤高、中、低剂量组，另选10只青年雌性大鼠作为青年对照组。连续灌胃处理4周后，采用蛋白印迹（Western blot）及RT-PCR检测大鼠卵巢中Bcl-2和Bax蛋白及基因的表达。结果：与模型组相比，滋肾清心汤高剂量能显著降低卵巢组织中Bax蛋白的表达，显著上调Bcl-2/Bax的比值；滋肾清心汤各剂量均能明显降低卵巢组织中Bax基因表达，明显升高Bcl-2基因表达，从而显著上调Bcl-2/Bax比值，延缓卵巢颗粒细胞的凋亡。结论：滋肾清心汤通过调节围绝经期大鼠卵巢中凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白及基因的表达，上调Bcl-2/Bax蛋白及基因的比值，从而延缓卵巢衰老，这可能是其治疗围绝经期综合征的分子机制之一。

围绝经期综合征 滋肾清心汤 卵巢 细胞凋亡 bcl-2 bax 实验研究

围绝经期综合征是指妇女在绝经前后因为卵巢功能衰退，性激素水平波动而引起的一系列身体及精神心理症状。目前西医主要采用激素替代疗法（HRT）治疗[1]，该方法具有严格的适应证及禁忌证，大量临床研究表明激素替代疗法存在潜在的致癌危险及其他不良反应，多数患者难以接受。滋肾清心汤是在中医药理论的指导下，结合临床工作经验化裁而来，全方清心安神、滋肾养阴，临床治疗本病获得较好的疗效。本研究以卵巢细胞凋亡作为切入点，观察滋肾清心汤对初老大鼠卵巢细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响，探索滋肾清心汤在卵巢中可能的作用位点。

1 实验材料

1.1 实验动物SD大鼠，12～14月龄，40只，体重（350±20）g，经阴道脱落细胞涂片检查，呈现出动情周期紊乱、动情间期延长，确定为围绝经期鼠。4月龄大鼠10只，体重（200±20）g。大鼠均由浙江省动物实验中心提供。饲养条件：二级实验室，普通全价饲料喂养，自由摄水，室温（24±2）℃，湿度45%～ 65%。大鼠适应性喂养1周后开始实验。

1.2 主要试剂滋肾清心汤，组方：莲子心5g，黄连3g，钩藤15g，炒酸枣仁15g，浮小麦30g，丹参10g，干地黄10g，山茱萸9g。中药由江苏省中医院提供，水煎并浓缩，相当于生药3.2g/mL，4℃冰箱中保存备用。中药剂量按人体重60kg，5倍系数计算。内参一抗（β-Actin）由Immunoway公司提供，二抗（羊抗小鼠IgG-HRP），二抗（羊抗兔IgG-HRP）由Jackson公司提供。cDNA第一链合成试剂盒和Taq DNA Polymerase由Thermo Fisher公司提供。Regular Agarose G10由Biowest公司提供。50×TAE电泳缓冲液由KeyGen公司提供。

2 实验方法

2.1 分组与给药将更年期大鼠随机分为4组：更年期大鼠模型组（模型组）和清心滋肾方高、中、低剂量组。另取10 只4月龄大鼠作为青年对照组。清心滋肾方高、中、低剂量组分别灌服滋肾清心汤32g/（kg·d）、16g/（kg·d）、8g/（kg·d）。每日给大鼠灌胃1次，连续4周。模型组和青年对照组给予生理盐水10mL/（kg·d）。每日给大鼠灌胃1次，连续4周。大鼠末次给药24h后断头处死，快速取出双侧卵巢，经液氮速冻后于-70℃冰箱冻存，用于组织蛋白的检测。

2.2 Western blot法检测卵巢中Bcl-2及Bax蛋白的表达提取大鼠卵巢总蛋白，进行SDS-PAGE转膜，用质量浓度为30g/L（0.03g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）37℃封闭1h，再分别用Bcl-2、Bax和β-actin兔抗鼠多克隆抗体（1∶400）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。最后用ALP标记的山羊抗兔IgG（1∶500）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。NBT/BCIP显色。以β-actin作为内参照。

2.3 RT-PCR方法检测卵巢中Bcl-2、Bax的基因取卵巢组织进行RNA提取，提取后进行RNA浓度和纯度的鉴定，经鉴定符合实验要求后，进行cDNA第一链合成（20μL体系），然后进行PCR实验。取灭过菌且无核酸酶的0.2mL离心管，在冰上依次加入如下组分：10×Taq Buffer 5μL；MgCl2（25mmol/L）4μL；dNTPs（10mmol/L）1μL；引物Ⅰ（10μmol/L）1μL；引物Ⅱ（10μmol/L）1μL；cDNA1μL；TaqDNA Polymerase 0.5μL；灭菌双蒸水至总体积50μL。第一阶段：95℃、5min预变性；第二阶段：95℃、40s，56℃、40s，72℃、45s，32个循环，退火、变性、延伸；第三阶段：72℃、10min最终延伸。引物序列及PCR产物大小见表1。

表1 引物序列及PCR产物大小

3 实验结果

3.1 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达治疗后滋肾清心方各组均可升高围绝经期大鼠卵巢中的Bcl-2蛋白，与青年对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；降低Bax蛋白，与青年对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；升高Bcl-2/Bax蛋白的比值，与青年对照组比较中、低剂量组具有显著性差异（P＜0.01），高剂量组未见差异性（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2及Bax蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2及Bax蛋白表达比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与青年对照组比较，▲▲P＜0.01。

组别动物数（只）Bax Bcl-2Bcl-2/Bax青年对照组100.4033±0.0581**1.0100±0.35232.3504±0.9792**模型组101.0333±0.1812▲▲0.5167±0.19060.4629±0.1980▲▲滋肾清心汤低剂量组100.9133±0.13170.5933±0.22820.6105±0.2620▲▲滋肾清心汤中剂量组100.7433±0.17850.7267±0.31870.9057±0.3589▲▲滋肾清心汤高剂量组100.5633±0.2255*0.8867±0.34971.5153±0.4794*

3.2 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2及Bax基因的表达见表3。

表3 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2及Bax基因表达比较（±s）

表3 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2及Bax基因表达比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与青年对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别动物数（只）bax bcl-2Bcl-2/Bax青年对照组100.9990±0.1590**0.9994±0.0031*1.0005±0.0170**模型组108.8051±0.78870.1526±0.02970.01712±0.0020滋肾清心汤低剂量组106.4810±0.6566**▲▲0.2803±0.0216*▲0.0436±0.0063*▲▲滋肾清心汤中剂量组104.7383±0.5839**▲▲0.4732±0.0164*▲0.1009±0.0131**▲▲滋肾清心汤高剂量组102.5693±0.3544**▲▲0.6444±0.0045*▲0.2543±0.0384**▲▲

4 讨论

围绝经期综合征是妇女绝经前后出现性激素波动或减少所致的一系列身体及精神心理症状。现代医学认为妇女进入围绝经期后，卵巢功能衰退，分泌的雌激素减少，卵泡期延长，卵泡逐渐停止发育。由于雌激素分泌减少，对垂体的负反馈减弱，破坏了下丘脑—垂体—卵巢轴的平衡，产生下丘脑和垂体功能亢进的现象[2]。这些内分泌环境的变化导致脑内β-内啡肽和5-羟色胺水平异常，一氧化氮、内皮素的异常，CD3+、CD4+减少、CD8+增加等，从而出现精神情绪变化失调，交感神经系统、体温调节中枢不稳定，血管舒缩平衡失调，免疫功能降低等一系列临床症状。

目前研究认为是颗粒细胞的凋亡触发卵泡闭锁[3]。更年期妇女卵泡及颗粒细胞的急剧减少，产生的雌激素及促性腺激素受体减少，从而出现卵巢功能的减退。目前已经阐明的凋亡信号传导途径主要有两条：一条是细胞表面死亡受体途径，另一条是线粒体途径，这两条途径最终都汇集为Caspases家族蛋白酶的级反应过程[4]。Bcl-2和Bax在线粒体应激诱导的细胞凋亡中起关键作用。Bcl-2及Bax同属于Bcl-2基因家族，Bcl-2能抑制细胞凋亡，Bax能促进细胞凋亡，Bax与bcl-2形成异二聚体复合物，维持促凋亡基因在细胞内的定位分布，使细胞不进入凋亡程序[5]。但当Bax蛋白超表达时，Bax/Bax同源二聚体的数量明显升高，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡；当Bcl-2表达增高时，Bax/Bax二聚体解离，生成稳定的Bcl-2Bax异源二聚体，对抗Bax的诱导凋亡作用[6]。已有研究表明，一切促进或抑制细胞凋亡的作用，都可归结成Bcl-2/Bax比值的变化[7]。

为更确切地了解滋肾清心汤治疗围绝经期综合征的作用位点，我们对Bcl-2、Bax同时进行了基因和蛋白的检测。结果表明，滋肾清心汤能够促进围绝经期大鼠卵巢组织中Bcl-2的表达，抑制卵巢颗粒细胞凋亡，并能抑制Bax诱导卵巢颗粒细胞凋亡的作用，从而延缓卵巢衰老，这可能是其治疗围绝经期综合征的作用机制之一。

本实验中采用RT-PCR与Westren blot检测，对基因的调节作用较蛋白质显著。其原因可能是，在细胞内，蛋白质是决定细胞基因表型及对外信息发生的反应性，蛋白质水平的表达不仅取决于基因转录的速率，也与mRNA的出核过程、细胞浆定位、转录物的稳定性、mRNA翻译调节及蛋白质的降解密切相关，蛋白质的生物活性及功能主要通过翻译后加工、磷酸化及蛋白酶的水解而发生[8]，基因转录的mRNA水平并不能完全可靠地代替其相应蛋白质的水平。

[1]Shuster LT，Rhodes DJ，Gostout BS，et al.Premature menopause or early menopause：long-term health consequences.Maturitas，2010，65（2）：161

[2]司徒仪.中西医结合妇产科学.北京：科学出版社，2003：189

[3]秦佳佳.中成药坤宁安调控围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子Bcl-2 mRNA表达的特点.中国临床康复，2006，10（19）：149

[4]Riedl S J，Shi Y.Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2004，5 （11）：897

[5]Kawatani M，Imoto M.Deletion of the BH1 domain of Bcl-2 accelerates apoptosis by acting in a dominant negative fashion. Journal of Biological Chemistry，2003，278（22）：19732

[6]Tsukahara S，Yamamoto S，Shwe T T W，et al.Inhalation of low-level formaldehyde increases the Bcl-2/Baxexpression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice. Neuroimmunomodulation，2006，13（2）：63

[7]SprickMR，WalczakH.TheinterplaybetweentheBcl-2 family and death receptor-mediated apoptosis.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular Cell Research，2004，1644 （2）：125

[8]Gygi S P，Rochon Y，Franza B R，et al.Correlation between protein and mRNA abundance in yeast.Molecular and cellular biology，1999，19（3）：1720

编辑：吴宁

R289.53文献识别码A

1672-397X（2014）09-0071-02

雷雯（1987-），女，硕士研究生，中医妇科学专业。

卢苏，lusu0926@sina.com

2014-03-20