应用16SrRNA基因序列分析快速鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌

姚纲　胡红焱　梁慧等

[摘要] 目的 探索一种快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌的方法。 方法 利用PCR技术扩增待检菌株的16 S rRNA基因序列，通过分析待检菌株的16 S rRNA基因序列对其进行鉴定。 结果 5株待检菌株的16 S rRNA基因序列均成功扩增，其中4株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列相似率达99.9%以上，将其鉴定到种的水平，1株的16 S rRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列相似率为97.09%，将其鉴定为雷弗森菌属。 结论 应用16 S rRNA基因序列分析可快速、准确地鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌。

[关键词] 16 S rRNA基因；细菌鉴定；革兰氏阳性杆菌

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）03（a）-0094-03

近年来，随着人口老龄化、免疫损害宿主增加等因素的影响，革兰氏阳性杆菌感染的发病率有升高趋势[1-3]。常见的革兰氏阳性致病杆菌有单核细胞增生性李斯特菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、诺卡菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌以及炭疽杆菌等。革兰氏阳性杆菌感染其表型特征的敏感性及特异性较差，通过常规检验手段对其进行快速、准确的鉴定比较困难。2012年3～10月，本研究从临床标本中相继分离出5株革兰氏阳性无芽胞杆菌。为了快速、准确地鉴定这些菌株，笔者利用PCR技术对其16 S rRNA基因进行扩增，然后通过16 S rRNA基因序列分析将其鉴定至属或种的水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株革兰氏阳性杆菌均分离自北京武警总医院各科临床标本，菌株编号分别为QC0411、QC0823、Y0720、Z0802、20983。

1.1.2 试剂 Chelex-100树脂（伯乐公司，美国），琼脂糖G-10（Gene公司，美国），溴乙锭（Promega公司，美国），Ex Taq聚合酶试剂盒及DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程大连有限公司。16 S rRNA基因的扩增选用16 S rRNA基因细菌通用引物（F：5′-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[4]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 仪器 TC-312 PCR仪（Techne公司，英国），EPS-100核酸电泳仪（圣科仪器设备有限公司，上海），Gel Logic 100凝胶电泳成像仪（柯达公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 参照文献[5]用Chelex-100法提取。

1.2.2 16 S rRNA基因扩增 16 S rRNA基因扩增反应体系由10×Ex Taq 缓冲液（Mg2+ Plus）5 μl、dNTP 混合物（各2.5 mmol/L）4 μl、引物F（10 μmol/L）及引物R（10 μmol/L）各2 μl、Ex Taq聚合酶 （5 U/μl） 0.25 μl、基因组DNA 4 μl组成，最后用无菌去离子水补足至50 μl。PCR反应条件为95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环后72℃延伸5 min。

1.2.3 扩增结果检测 取5 μl PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后通过凝胶电泳成像仪照相观察，确认目标基因扩增成功后，PCR产物送北京天一辉远生物科技公司测序。

1.2.4 同源性鉴定 将测得的16 S rRNA基因序列用Vector NTI Advance（v.11.5.1）序列分析软件包进行人工校读，去除两端测序图谱不清容易引起混淆的序列，并对2个引物的双向测序结果进行拼接[6]。登陆GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和核糖体工程数据库（http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp），将测得的各菌株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列进行同源性比对。

2 结果

2.1 16 S rRNA基因扩增结果

所有菌株的16 S rRNA基因均扩增成功，反应产物经电泳检测在约1500 bp处有一清晰条带，与预期目的片段长度相符（表1）。

3 讨论

传统的细菌鉴定以分离培养为前提，然后依据其形态学、生理生化特征进行鉴定，从标本采集到得出明确的鉴定结果往往需要3～4 d甚至更长时间，且准确性不十分理想，给临床及时指导诊治带来一定的困难。微生物自动鉴定系统的推广应用使这一现象有所改观，但这种完全基于表型特征的鉴定技术仍然具有内在的缺陷。PCR扩增技术及DNA 分子测序技术的发展，为细菌在基因水平的鉴定提供了技术保障，16 S rRNA基因序列分析已被广泛应用于细菌鉴定[7-8]。本研究通过扩增、分析待检菌株的16 S rRNA基因序列，对5株革兰氏阳性杆菌进行了快速、准确的鉴定，给临床及时诊治提供了可靠的依据。

16 S rRNA基因序列揭示了物种间内在的亲缘关系及其演化过程，目前已成为细菌鉴定的“金标准”。16 S rRNA基因序列全长约1550 bp，其核苷酸序列具有高度保守性，同时在保守区之间存在9～10个可变区，可变区在不同科、属、种间存在一定的变异，可通过比较不同细菌的16 S rRNA基因序列间的差异对其进行分类鉴定[8]。随着PCR及自动化DNA测序技术的不断发展，细菌16 S rRNA基因序列分析的研究越来越成熟。目前，几乎所有病原菌的16 S rRNA基因均已完成测序并录入基因库[7]。Bosshard等[9]认为，16 S rRNA基因序列相似率>99%鉴定为同一个种，95%～99%鉴定为同一个属。本研究中4株待检菌株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列相似率达99.9%以上，据此将其鉴定到种的水平；菌株Y0720的16 S rRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列相似率为97.09%，将其鉴定为雷弗森菌属。用此项技术鉴定临床标本中的细菌，从标本送检到得出鉴定结果，整个过程只需2～3 d，且鉴定指标单一、明确，即以保守的16 S rRNA基因序列为基准，通过可变区序列的差异加以鉴定，而传统技术必须综合大量的指标才能鉴定[10]，所以，对于临床少见细菌及非典型菌株的鉴定，16 S rRNA基因序列分析可作为常规鉴定方法的有力补充，但由于原核生物的16 S rRNA基因序列具有高度保守性，故对于亲缘关系较近的种或同一种内不同菌株间的鉴别分辨力有限，且基因扩增、测序只能在具有一定条件的机构和地区开展，因而限制了此项技术的应用。

[参考文献]

[1] 陈东科，沙丽嗒娜提·贺纳亚提，许宏涛，等.纹带棒杆菌在临床标本中的分布及耐药性调查[J].中华医院感染学杂志，2010，20（2）：285-287.

[2] Budzik JM，Hosseini M，Mackinnon AC Jr，et al.Disseminated Nocardia farcinica：literature review and fatal outcome in an immunocompetent patient[J].Surg Infect （Larchmt），2012，13（3）：163-170.

[3] Moon JH，Cho WS，Kang HS，et al.Nocardia brain abscess in a liver transplant recipient[J].J Korean Neurosurg Soc，2011，50（4）：396-398.

[4] Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al.16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol，1991，173（2）：697-703.

[5] 姚纲，胡红焱，梁慧，等.Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA[J].当代医学，2013，（25）：15-17.

[6] Lu G，Moriyama EN.Vector NTI，a balanced all-in-one sequ-ence analysis suite[J].Brief Bioinform，2004，5（4）：378-388.

[7] Wellinghausen N，Kochem AJ，DisquéC，et al.Diagnosis of bacteremia in whole-blood samples by use of a commercial universal 16 S rRNA gene-based PCR and sequence analysis[J].J Clin Microbiol，2009，47（9）：2759-2765.

[8] 沈亚娟，夏云.16 S rRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究[J].重庆医学，2013，42（1）：46-48.

[9] Bosshard PP，Abels S，Zbinden R，et al.Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic Gram-positive rods in the clinical laboratory （an 18-month evaluation）[J].J Clin Microbiol，2003，41（9）：4134-4140.

[10] 张志明，孙海英，李建平.16 S rRNA在医学微生物鉴定中的应用[J].国际检验医学杂志，2010，31（4）：349-350.

（收稿日期：2014-01-22 本文编辑：许俊琴）

[参考文献]

[1] 陈东科，沙丽嗒娜提·贺纳亚提，许宏涛，等.纹带棒杆菌在临床标本中的分布及耐药性调查[J].中华医院感染学杂志，2010，20（2）：285-287.

[2] Budzik JM，Hosseini M，Mackinnon AC Jr，et al.Disseminated Nocardia farcinica：literature review and fatal outcome in an immunocompetent patient[J].Surg Infect （Larchmt），2012，13（3）：163-170.

[3] Moon JH，Cho WS，Kang HS，et al.Nocardia brain abscess in a liver transplant recipient[J].J Korean Neurosurg Soc，2011，50（4）：396-398.

[4] Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al.16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol，1991，173（2）：697-703.

[5] 姚纲，胡红焱，梁慧，等.Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA[J].当代医学，2013，（25）：15-17.

[6] Lu G，Moriyama EN.Vector NTI，a balanced all-in-one sequ-ence analysis suite[J].Brief Bioinform，2004，5（4）：378-388.

[7] Wellinghausen N，Kochem AJ，DisquéC，et al.Diagnosis of bacteremia in whole-blood samples by use of a commercial universal 16 S rRNA gene-based PCR and sequence analysis[J].J Clin Microbiol，2009，47（9）：2759-2765.

[8] 沈亚娟，夏云.16 S rRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究[J].重庆医学，2013，42（1）：46-48.

[9] Bosshard PP，Abels S，Zbinden R，et al.Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic Gram-positive rods in the clinical laboratory （an 18-month evaluation）[J].J Clin Microbiol，2003，41（9）：4134-4140.

[10] 张志明，孙海英，李建平.16 S rRNA在医学微生物鉴定中的应用[J].国际检验医学杂志，2010，31（4）：349-350.

（收稿日期：2014-01-22 本文编辑：许俊琴）

[参考文献]

[1] 陈东科，沙丽嗒娜提·贺纳亚提，许宏涛，等.纹带棒杆菌在临床标本中的分布及耐药性调查[J].中华医院感染学杂志，2010，20（2）：285-287.

[2] Budzik JM，Hosseini M，Mackinnon AC Jr，et al.Disseminated Nocardia farcinica：literature review and fatal outcome in an immunocompetent patient[J].Surg Infect （Larchmt），2012，13（3）：163-170.

[3] Moon JH，Cho WS，Kang HS，et al.Nocardia brain abscess in a liver transplant recipient[J].J Korean Neurosurg Soc，2011，50（4）：396-398.

[4] Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al.16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol，1991，173（2）：697-703.

[5] 姚纲，胡红焱，梁慧，等.Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA[J].当代医学，2013，（25）：15-17.

[6] Lu G，Moriyama EN.Vector NTI，a balanced all-in-one sequ-ence analysis suite[J].Brief Bioinform，2004，5（4）：378-388.

[7] Wellinghausen N，Kochem AJ，DisquéC，et al.Diagnosis of bacteremia in whole-blood samples by use of a commercial universal 16 S rRNA gene-based PCR and sequence analysis[J].J Clin Microbiol，2009，47（9）：2759-2765.

[8] 沈亚娟，夏云.16 S rRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究[J].重庆医学，2013，42（1）：46-48.

[9] Bosshard PP，Abels S，Zbinden R，et al.Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic Gram-positive rods in the clinical laboratory （an 18-month evaluation）[J].J Clin Microbiol，2003，41（9）：4134-4140.

[10] 张志明，孙海英，李建平.16 S rRNA在医学微生物鉴定中的应用[J].国际检验医学杂志，2010，31（4）：349-350.

（收稿日期：2014-01-22 本文编辑：许俊琴）