紫贻贝酸性磷酸酶综合性和设计性实验的开设

于乐军　刘晨光　李立德

摘 要 开设综合性、设计性实验，提高学生的动手能力和创新意识，已成为当前实验教学改革的总体趋势。就中国海洋大学酶工程实验开设的酸性磷酸酶综合性和设计性实验，从选题依据、实验设计安排、实验内容关键点、实验设计心得等5个方面进行介绍。本实验取材经济方便，操作简单易行，适合于东部沿海相关大专院校本科酶学实验教学。

关键词 紫贻贝；综合性实验；设计性实验；酸性磷酸酶

中图分类号：G642.423 文献标识码：B

文章编号：1671-489X（2014）04-0106-03

酶工程是中国海洋大学生命专业生物科学及生物技术专业学生的专业选修课，经过几年的发展，已经形成了学校独特的教学理念及内容。实验教学一直被认为是理论教学最好的补充，是联系理论与实践的桥梁[1]。但由于种种原因，中国海洋大学酶工程实验教学一直处于空白状态。虽然生物化学实验课也开设了有关酶学方面的实验，但远远不能满足学生对于知识的渴求，以及学校加强实践教学的要求。为此，经过反复讨论与实验，为选修酶工程实验的学生开设了酸性磷酸酶综合性和设计性实验。现将相关实验内容介绍如下，希望为相关院校开设综合性及设计性实验提供一些可供借鉴的经验及内容。

1 选题依据

中国海洋大学是一所以海洋和水产为特色的综合性大学，正朝着建设特色显著的高水平研究型大学高速前行。为彰显学科特色，选择海洋生物——紫贻贝作为实验材料。紫贻贝俗称海红、淡菜，是广泛分布于我国东部沿海的一种常见贝类，其肉味鲜美，营养价值高，且价格便宜，成本低。组织学及组织化学研究发现[2]，紫贻贝消化腺中含有多种酶类，又尤以酸性磷酸酶（acid phosphatase EC3.1.3.2，ACP）的活性较高。酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶，是溶酶体的标志酶，而溶酶体的基本功能是对生物大分子的强烈消化作用，以维持细胞的正常代谢活动。在临床上，酸性磷酸酶测定主要用于前列腺癌等疾病的辅助诊断。因此，对酸性磷酸酶的研究不但对于紫贻贝的养殖有一定的意义，并且对于人体一些疾病的诊断和预防也能起到积极的作用。

另外，实验前期，以紫贻贝酸性磷酸酶分离纯化为主要内容的两项本科生SRDP项目已对紫贻贝酸性磷酸酶的提取、分离纯化及其酶学性质进行了初步的研究，实验过程充分展示了本实验的良好再现性，并且通过验收顺利结题，这也为本实验能顺利开展提供了良好的理论及实践基础。

2 实验设计安排

近几年来，由于教育部《关于进一步加强高等学校本科教学工作的若干意见》中明确提出了“积极推动研究性教学，提高大学生的创新能力，增加综合性与创新性实验”的要求，许多地方高校在其专业实验中不同程度地开设了综合性和设计性实验，但往往两者之间相互独立，自成体系，只能发挥其单一的作用。将综合性和设计性实验有机地结合在一起，不仅能使实验前后连贯，成为一个整体，而且将有助于两者共同发挥作用，起到“1+1>2”的效果。因此，本实验设计遵从这一原则，在综合性实验后安排设计性实验，设计性实验是综合实验的延伸和拓展，实验前后连贯，构成一个整体。

先用苯酚作出酚标准曲线，然后在35 ℃下，将酶液加入盛有磷酸苯二钠溶液的试管中，精确反应10 min，加入1 mol/L碳酸钠溶液终止反应，再加入Folin-酚试剂，35 ℃精确反应10 min，同时以不加酶液，但反应条件一致的另一试管作为空白对照，测定在OD680 nm下的吸光度。由标准曲线公式计算出样品吸光度所对应的结晶酚浓度，通过相应公式计算酶活力。

蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G250染色法测定。考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595 nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高。

酸性磷酸酶米氏常数Km的测定 测定Km和Vm，特别是测定Km，是酶学工作的基本内容之一。在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。米氏常数的测定一般通过作图法求得。作图方法很多，其共同特点是先将米氏方程式变换成直线方程，然后通过作图法求得。本实验采用最常用的双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）求得。

酸性磷酸酶凝胶过滤柱层析 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的一种层析方法。本实验选取葡聚糖凝胶Sephadex G-150作为凝胶填料，用0.01 mol/L醋酸缓冲液作为洗脱液进行凝胶过滤柱层析。

酸性磷酸酶凝胶电泳 酸性磷酸酶凝胶电泳采用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）垂直板电泳，浓缩胶和分离胶浓度分别为5%和10%，其中关键的样品溶解缓冲液体系包括：1.0 mol/L，pH6.8 Tris-HCl缓冲液0.5 ml、甘油0.8 ml、10% SDS 1.6 ml、2-巯基乙醇0.4 ml、0.05%溴酚蓝0.2 ml和蒸馏水（双蒸水）4.5 ml，总体积8 ml[3]。

酸性磷酸酶固定化 综合实验中酶固定化采用物理吸附法，使用活性炭作为吸附剂，将酶液吸附后，经离心得到的沉淀即为固定化酶。设计实验中要求学生以来源于海洋生物的两种材料——海藻酸钠和壳聚糖为固定化材料，设计酶固定化实验。

酸性磷酸酶性质研究 设计实验酸性磷酸酶性质研究主要包括温度、pH值、热稳定性、金属离子、化学修饰剂对酶活力的影响。要求每组学生至少设计两种因素对酶活力的影响，并且各组间尽量不要重合。

4 实验设计心得

1）本实验设计是以酸性磷酸酶为主线，运用了离心、分光光度、层析技术、电泳技术、透析等酶工程相关专业技术对紫贻贝酸性磷酸酶进行提取、分离纯化到固定化的综合性实验，并在综合实验的基础上开设两个设计性实验。设计性实验不是独立于整个实验体系外，而是整个体系的延伸和拓展，使整个实验过程前后连贯，构成一个完整的整体。这样将综合性实验与设计性实验有机地结合起来，不仅有利于培养学生的实验动手能力和综合分析能力，而且有利于培养学生的创新能力及创新意识，更有利于调动学生对酶工程实验的积极性及主动性，从而达到“1+1>2”的效果。

另外，设计性实验与综合性实验构成一个整体，也使得学生在查阅相关资料、设计实验方案时有的放矢，提高设计方案的可行性，为取得良好的实验效果奠定基础。

2）本实验的实施采用“开放自主式”的实验模式。开放自主式实验教学能使学生从“被动、封闭、受束缚”的状态变成“主动、开放、较自由”的状态，真正地成为实验的主人、教学的主体，充分地锻炼了学生“大脑”和“双手”[4]。由于中国海洋大学基础实验中心实验室采用门禁系统管理，因此将学生的智能卡开卡后，学生可随时进入实验室实验，这就保证了实验室全天候的开放。在规定的时间内，学生从实验材料的购买、实验试剂的配制、实验仪器的组装，到设计性实验的方案设计、实验的操作，都自主完成，教师只起到掌控全局、适时指导和适当监督的作用[5]。

3）实验分成若干个小组，并且采取组长负责制。由于本次大实验的实施是在学生上课阶段，因此不是每个学生都有时间在同一时间内做实验。这就要求组长进行协调和分配，整个小组成员相互协作，做好实验计划安排，保证实验在规定的时间内高质量、高水平地完成。同时也锻炼了学生在组织协调及相互协作方面的能力。

4）在酶学固定化实验设计中，海藻酸钠和壳聚糖两种材料可单独作为包埋材料进行实验设计，也可两种材料结合起来，设计两种材料的复合微球。最后，将几种固定化酶的效果进行比较，这样做不仅使学生更加直观地掌握了几种固定化方法，而且有利于提高学生在综合知识方面的能力。

5）实验安排时，不是简单地罗列出实验步骤，而是在每个实验后面附有2～3个思考题。比如在酶活测定时，思考题为：如果用定磷法设计酶活实验，该如何设计？再如在酶的凝胶电泳时，思考题为：如果样品不用还原剂处理，电泳结果将会如何？这些问题的提出，有助于学生主动去思考问题、解决问题，并将其更好地应用于实验中，调动学生对实验的积极性和主动性。

5 结束语

随着各高校对教育部《关于进一步加强高等学校本科教学工作的若干意见》的进一步落实，开设综合性、设计性实验，提高学生的动手能力和创新意识，已成为当前实验教学改革的总体趋势[6-8]。综合性和设计性实验总体方案的设计应该具有连贯性、系统性、科学性和实用性，并且要经常在原有基础上拓展新的实验项目。只有这样，才能不断调动学生对实验的积极性和主动性，培养学生的创新意识和创新精神。

未来，还要在本实验的基础上，进一步深化和拓展，比如酶的克隆与表达、酶的定向进化、酶的中试生产、酶的应用等方面，力争使本综合性设计性实验涵盖酶工程上、中、下游的各个方面，为国家和社会培养具有专业酶工程知识和技术的高素质人才。

参考文献

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[3]丁益，等.生化分析技术实验[M].北京：科学出版社，2012：75-82.

[4]孙吉康.《蛋白质与酶工程》课程实验教学改革的探索与实践[J].中南林业科技大学学报：社会科学版，2010，4（4）：134-136.

[5]邓红梅，周天，等.开设综合性、设计性实验教学探讨[J].实验科学与技术，2012，10（4）：148-151.

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[8]侯勇，龚竞，等.综合性酶学实验与学生创新能力的培养[J].实验科学与技术，2009，7（3）：90-91，164.