噬菌体在污水处理系统中的应用

易 鑫，李 娟，黄 京，程 正，刘新春

(1.中国科学院大学资源与环境学院，北京 100049;2.珠海市水质监测中心，广东珠海 519020)

为应对日益突出的水资源短缺问题，人们越来越多地将生活污水经再生处理后用作绿化或景观用水，用以改善城市的生态环境并节约宝贵的水资源，但再生水回用所引起的病原菌污染问题也正时刻威胁着人类健康，尤其是一些高致病性的病原菌流入水环境，对人体健康和生态安全构成了直接的威胁［1-3］。近年来，由于病原体对水体的污染，也时常引发水媒型传染病的爆发［4，5］。据估计，单由水媒型传染病所造成的死亡人数约占全世界总死亡人数的4%［6］。由此可见，控制致病菌向环境的排放有着十分重要的现实意义。

尽管目前污水处理工艺，能去除大部分的病原菌，大肠杆菌的去除可以达到2～3个数量级［7-9］，但出水中大肠杆菌浓度依然严重超标。因而，需配以切实有效的致病菌防治措施，消除其危害。理论上讲，加氯消毒方法可解决这一问题，但操作起来难度较大。因加氯太少，达不到消毒效果;加氯过多，又将导致消毒成本奇高，且易产生三氯甲烷、卤乙腈等二次污染物［10］。此外，加氯消毒的方法并不是对所有的病原体都有效，且加氯消毒后排入环境的再生水也仍然存在较大的健康风险。消毒措施之外的另一有效途径就是利用噬菌体技术处理污水中的病原菌。

噬菌体是一类感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒的总称，具有特异性强、自我增殖快、来源极广等其他一些抗菌剂无法比拟的优点［11］。噬菌体疗法也逐渐成为抗耐药菌研究领域的新热点［12］。Withey等［13］认为噬菌体处理技术有可能是一种长期的、有效的病原菌处理方式。

1 噬菌体的基本特征

噬菌体(bacteriophage)具有高度严格的宿主特异性，往往一种噬菌体只侵染一种细菌或只侵染某一菌株，而不会对动植物细胞进行侵染并且只寄居在易感染宿主菌体内。它广泛存在于自然界中，地球上大概有1032个噬菌体存在，是细菌数量的10多倍。可以说凡有细菌的地方，就会有噬菌体的踪影［14］。2005年国际病毒分类委员会依据病毒核酸类型、形态结构等特征对已经确认的噬菌体进行了系统的分类与命名。除形态学分类外，根据与宿主菌作用模式的不同，通常可将噬菌体分为温和噬菌体和烈性噬菌体。其中一个烈性噬菌体感染一个细菌后，只需重复4个感染周期后，即可杀灭10亿个细胞［15］。其杀死细菌的机制与抗生素不同，十分适合成为理想的“新作用模型”的新型抗菌剂。相比较而言，温和噬菌体在病原菌防治上的实用价值并不高，因此，通常提到的治疗细菌感染等的噬菌体均为烈性噬菌体。

2 噬菌体技术的优势及局限

(1)噬菌体技术相比于其他物理、化学药剂等处理技术具有以下优势:

1)噬菌体具有高度的特异性。只裂解相应病原菌，不破坏其他正常菌群，从而避免引起如腹泻、胃肠感染等副作用。另外有证据显示即使是一部分存在免疫缺损的病人服用噬菌体治疗细菌性感染也是很安全的［16］。

2)噬菌体可指数增殖［17］。在适当的条件下，每一个裂解周期内，每一个噬菌体都可以产生200个子代噬菌体将以200n增殖。

3)细菌较难产生抗性。据报道［18］细菌对噬菌体产生抗性的突变频率为10－7，而对抗生素的抗性突变频率为10－6。另一方面，即使细菌产生一定的变异或抗性，噬菌体也能在一定条件下，迅速反应并产生相应的变异以感染变异细菌。

4)无残留。噬菌体高度依赖宿主菌，随宿主菌的死亡而死亡，因此只在细菌感染部位发生作用，而不会引发其他感染，更不会残留在体内［19］。

5)噬菌体研制时间短，成本低。筛选新的噬菌体来裂解耐药菌株的工作相对较快，有时仅通过一定的离心即可去除细菌碎片纯化噬菌体，易保存、运输［19］。从进化的观点看，完全可利用自然选择来筛选噬菌体治疗耐药或耐噬菌体的细菌。

(2)尽管噬菌体技术拥有诸多的优势，但也存在一定的局限:

1)对宿主的高度特异性，使噬菌体的抗菌范围缩小。另外，环境中只有20%的细菌是可培养的，对相应噬菌体的培养分离产生了限制;

2)大部分细菌会对与共存噬菌体相同的噬菌体引起的感染产生抗性;

3)噬菌体稳定性差，易受环境胁迫、太阳辐射以及饥饿等因素影响，致使噬菌体数目减少;

4)缺乏鉴定噬菌体类别的标准，研究者因缺乏对噬菌体作用方式的了解，而无法区分温和噬菌体和烈性噬菌体，误将温和噬菌体用于治疗可能因温和噬菌体的感染形成基因的水平转移而致使非致病菌转化为致病菌［13］。

3 噬菌体在污水处理系统中的应用研究现状

相比于噬菌体应用于畜牧、水产以及食品等领域中病原性感染而言，噬菌体用于污水处理中的研究仍处于试验阶段。污水处理研究主要侧重于噬菌体作为细菌检测指示物以及在生活污水、活性污泥中提取并培育纯化噬菌体，并且基本停留在对其种类鉴定和基本生物特性研究上。而在防治水中高发性致病菌方面的研究几乎为空白。结合当前对噬菌体用于其他领域病原菌防治技术的应用，尤其是借鉴一些较为成熟、安全可靠的噬菌体防治技术，通过选择典型的污水处理工艺进一步调查研究主要高致病菌在水处理工艺过程中的分布与归趋，优化试验设计，再结合高致病菌归趋途径针对的投加单一或多种混合制剂的噬菌体，由小试试验来确定噬菌体对相关高致病菌的去除效果并累积相应的技术参数，为逐步发展推广并广泛用于水媒型致病菌的防治，尤其对污水处理系统中存在的复杂多样的高致病菌的防治。

3.1 噬菌体监测病原菌

相比于传统培养技术，用噬菌体检测病原菌的操作具有特异性强、快捷、安全和设备简单等优点。美国EPA［20］和澳大利亚昆士兰政府［21］均已提出用大肠杆菌噬菌体作为病毒指示生物。Edgar等［22］利用量子点的方法与工程噬菌体相结合从而特异识别目标细菌或从临床及环境中分离细胞。其中，噬菌体作为模式病毒，已被用于评价水和污水的处理效率、阐明病毒灭活机理及改进病毒检测方法等领域的研究［23-25］。另外，利用噬菌体分型的技术也可方便区分细菌隔离群，并在流行病学研究中得到应用。肠出血性大肠杆菌(EHEC)～I弯曲杆菌的研究［26］表明噬菌体的分型是非常有用的。近期有研究［27］发现，粪肠球菌噬菌体可用于检测娱乐用水以及污水等水体中大肠杆菌数量，以此可作为评价水体粪便污染的指示物。李洁等［28］以在洱海下游水体中分离出肠道致病菌噬菌体，作为判断该水体遭受肠道致病菌的污染的指示标志。Jebri等［3］通过调查研究突尼斯3个不同污水处理厂污水及活性污泥中噬菌体数量并以此作为除细菌指标之外评价水体是否受肠道菌及肠道病毒污染的又一重要指标。

3.2 噬菌体去除病原菌

由于在污水处理系统中，某种或多种病原菌的去除或数量下降，可能涉及较为复杂的水处理工艺环节及其他环境因素。从整体研究来看，更多的研究倾向于将噬菌体只作为简单的病菌指示物对待，而忽视或未能深入研究噬菌体是否对去除病原菌起关键作用，因此有关噬菌体在污水处理过程中的作用知之甚少。Synnott等［29］通过将从污水中筛选分离出的3株宽谱噬菌体，制成混合制剂并成功用于裂解体外培养的E.coli O157:H7菌株;另外该研究组还从污水中分离出2株噬菌体可有效裂解金黄色葡萄球菌，对于牛乳腺炎的防治具有积极的意义。赵晨等［30］也从污水中分离纯化出一株高裂解活性的金黄色葡萄球菌噬菌体 SIIA-SAP009。Lin等［31］分离出10株多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)噬菌体，能裂解多株鲍曼不动杆菌，其中一株几乎可以彻底去除一种多重耐药性的鲍曼不动杆菌，这可能会是防治多重耐药性鲍曼不动杆菌的另一良方。Wu等［32］从污水中分离出的肺炎克雷伯杆菌噬菌体Kpp95，能快速裂解宿主菌，除了能裂解许多产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯杆菌，还能裂解产酸克雷伯杆菌、聚团肠杆菌、黏质沙雷菌。Turki等［33］对从废水中分离到的沙门氏菌噬菌体的感染进行了研究。结果表明该噬菌体可减少沙门氏菌和肠杆菌科的其他菌群，而不损害其他功能菌群。Heringa等［34］将从污水中分离的多株噬菌体混合可有效减少沙门氏菌数量。不少研究者着手噬菌体去除污水处理系统中的铜绿单胞杆菌的研究。其中Vieira等［35］从污水处理厂污水样品中筛选出一株噬菌体可有效抑制绿脓杆菌的生长。试验表明在感染复数(MOI)为10时，可最大程度的控制绿脓杆菌生长，同时并未发现绿脓杆菌对此株噬菌体产生抗性。Zhang等［36］试验表明噬菌体可通过其特异性选择性去除污水过滤系统中的宿主菌(铜绿假单胞菌)，在流量为1.6 mL/min，投加1 mL 浓度为5.1 ×106pfu(plaque forming units)/mL的噬菌体情况下，可有效去除无烟煤和活性炭过滤系统中的细菌，且在后续出水中无检出，并不会对氨氧化反应或氨氧化菌等菌群造成任何不良影响。Chaudhry等［37］从污水中分离出的一株噬菌体可有效裂解弗氏柠檬酸杆菌。

宽谱的噬菌体或噬菌体混合制剂可减少甚至消除某些细菌微生物，从而对微生物群落动态具有控制性的影响。Wei等［38］通过对霍乱弧菌和其特异性噬菌体连续培养试验以及建立数学模型，研究表明噬菌体可通过对霍乱弧菌的捕食作用来限制菌群数量，影响菌落的发展。同时研究还发现，单一的噬菌体并不能长久保持将细菌数量限制在较低水平，而两种噬菌体混合使用可降低菌落数量两个数量级。Satoh等［39］利用16S rRNA研究实验室活性污泥系统中细菌数量变化时发现其中一细菌分类单位可能被存在的特异性噬菌体消除。有研究者［40］通过连续流并以单独加氯(NaClO)、噬菌体以及二者结合的3种加药方式均可有效去除污水处理中铜绿假单胞菌膜，其中噬菌体与氯联合使用时效果((97±1)%)最好，而单独投加噬菌体和加氯的去除率分别为(89±1)%和(40±5)%;通过降低噬菌体使用量的同时缩短连续加氯时间，在36 h内即可去除(96±1)%的菌膜，这也为如何使用噬菌体用量和加氯时间的不断优化奠定了理论基础，为今后细菌膜的控制与去除提供了技术支持。Shapiro等［41］通过对处理高浓度工业废水的生物膜反应器长达462 d的连续调查发现噬菌体可通过对一种或多种宿主细菌的捕食决定污水处理系统中菌落的结构组成变化。Otawa等［42，43］对多种不同污泥水处理系统中的研究证实噬菌体可能决定菌落的结构与功能。

也有研究通过改变噬菌体给药的方式来增强噬菌体的稳定性，从而保持更持久的活性。Zhang等［44］研究表明噬菌体鸡尾酒制剂有可能具有更广泛的宿主范围，并且通过将污水中沙门氏菌的多种噬菌体通过低成本的噬菌体微胶囊化过程可以使噬菌体稳定性时间更长，更能发挥持久的防治效果。Stanford等［45］研究表明通过将噬菌体微胶囊化后在强酸性条件下仍可保持良好的活性。此外，也有研究表明噬菌体并不能完全消灭宿主菌，而是在互相竞争中达到共存的平衡状态。Kashiwagi等［46］研究发现噬菌体感染宿主菌大肠杆菌过程中，二者均会发生一定的突变以适应生存，大肠杆菌每复制一次的可突变约5.4×10－10bp，远低于噬菌体的1.5×10－3～10－5bp，但大肠杆菌也并不会因此而全部消亡，而是在这种不断的竞争中保持一定数量，二者因此共存。

3.3 噬菌体在污水处理中其他作用

在污水处理系统中，噬菌体除了有以上作用之外，噬菌体技术仍有多方面应用价值，如提高污泥脱水性能、消化能力以及控制丝状菌等［13］。Mandilara等［47］证明了污水中指示细菌及其噬菌体的相关性，并考虑到噬菌体相比于细菌指标在多个污水处理环节存在更高的抗性，可较为稳定地存在水体中且检测简单快速，并能潜在反映粪便污染，因此将其作为评估污水处理效果的工具。目前，已有研究将噬菌体应用于解决污水处理系统中的污泥膨胀问题。Kotay等［48，49］分别从污水处理系统中分离了针对丝状细菌Sphaerotilus natans的噬菌体，并证明了相应噬菌体可通过控制丝状菌的生长数量，从而降低曝气池SVI值，对防止污泥膨胀具有重要作用。

4 展望

就噬菌体在致病菌防治研究应用的发展进程来看，由于其强大的杀菌能力，作为治疗制剂使用的前景十分光明［50，51］;噬菌体在畜牧、水产养殖以及食品行业中治疗细菌感染尤其是耐药菌感染的防治效果得到大量动物等临床试验的充分肯定。但噬菌体正式用于动物或人类细菌性感染疾病的临床治疗，仍面临诸多严峻问题。有研究［52］显示目前世界范围内水媒型传染病的高发主要原因是由污水处理厂的污水排放引起此疾病传播。通过对当前使用最广最典型的污水处理工艺中一些高致病菌(比如大肠杆菌O157、沙门氏菌、军团菌和绿脓杆菌等突出的致病性强又易于传播的病菌)开展调查研究，进一步揭示此类病原菌不同季节在各个污水处理工艺的不同阶段的数量变化及归趋，做好实时的设点监测，从而为今后针对性超前性地投加相应的噬菌体制剂，进而防止致病菌的传播爆发发挥作用。通过研究并利用相应的生物工程改造，使其只侵染特定种类的病原菌，而对其他种类细菌的影响很小甚至没有，在去除病原菌的同时并不影响环境的安全。因此，应不断加强对于噬菌体防治病原菌技术的研究，并通过进一步的试验逐渐将其用于污水处理系统中病原菌的去除。

综上所述，噬菌体去除污水中病原菌技术，具有低成本、特异性较强及高效性的突出特点，在未来污水处理领域中的应用具有广阔的空间和良好的前景。

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