GRP78对结直肠癌细胞RKO增殖的影响

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(青岛大学医学院附属医院病理科，山东 青岛 266003)

GRP78对结直肠癌细胞RKO增殖的影响

刘丽丽，邢晓明

(青岛大学医学院附属医院病理科，山东 青岛 266003)

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对结直肠癌细胞RKO增殖的影响。方法通过脂质体2000将靶向GRP78的质粒转入RKO细胞,Western-blot方法检测GRP78在RKO细胞中的表达，CCK-8方法检测细胞的增殖能力。结果转染后,与对照组相比,RKO细胞GRP78蛋白表达明显降低(F=115.17，q=5.41、15.29，P<0.05);同时，RKO细胞的增殖水平也明显降低(F=45.60，q=11.16、12.17，P<0.05)。结论GRP78体外可促进结直肠癌增殖。

葡萄糖调节蛋白78;结直肠肿瘤;细胞增殖

葡萄糖调节蛋白78(GRP78),也称免疫球蛋白重链结合蛋白,是定位于内质网上的热休克蛋白70家族成员,具有保守的ATPase结构域和多肽结合结构域[1]。作为内质网主要分子伴侣之一，GRP78可以促进蛋白质在内质网中的正确折叠与组装，阻止错误折叠蛋白的蓄积，靶向降解错误折叠的蛋白，从而维持内质网内环境的稳定[2]。正常情况下，在正常成年人脑、肺、肝等器官组织中都有较低水平的GRP78表达，但当肿瘤发生时，GRP78的表达明显增高。近年来随着转基因技术及RNA干扰技术的不断进步，关于GRP78在肿瘤中作用的研究越来越深入。研究表明,GRP78可增强肿瘤细胞的增殖、侵袭能力以及对抗癌药物的耐受性,被视为肿瘤治疗反应的一种生物标志[3-4]。本文通过靶向GRP78的干扰质粒来抑制RKO细胞系GRP78蛋白的表达，观察GRP78对结直肠癌细胞增殖的影响。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞 人结直肠癌RKO细胞由浙江大学医学院分子病理学实验室提供。

1.1.2主要试剂 胎牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司，LB液体培养基由青岛大学医学院病原微生物学教研室提供，高纯度质粒小提中量试剂盒购自天根科技生物有限公司；兔抗人GRP78一抗购自美国Abcame公司，兔抗人β-actin一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国CST公司，细胞转染试剂及OPTI-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，细胞增殖CCK-8试剂盒购自日本同仁公司。

1.1.3主要仪器 荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)，电泳槽及凝胶成像系统(美国伯乐公司)，紫外线分光光度计、酶联免疫检测仪及4 ℃低温离心机(徳国Eppendorf公司)。

1.2实验方法

1.2.1质粒的抽提 质粒表达载体由上海吉玛公司构建, RNA干扰靶序列为5′-GCGCATTGATA-CTAGAAATGA-3′[5],靶向GRP78的质粒及阴性对照质粒大肠杆菌菌液保存于青岛大学医学院病原微生物学教研室。按照质粒抽提试剂盒说明书进行抽提，质粒储存于-20 ℃冰箱，用于细胞转染。

1.2.2细胞培养及转染 RKO细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中，细胞培养于含体积

分数0.10胎牛血清的RPMI-1640培养基中。将对数生长期的细胞接种于6孔板中，次日细胞的融合率达到90%左右，接种后24 h以内按脂质体Lipofectamine 2000说明书进行转染[5]。实验分为3组：实验组，转染时加入脂质体Lipofectamine 2000及靶向GRP78质粒; 阴性对照组，转染时加入脂质体Lipofectamine 2000及阴性对照质粒；空白对照组,转染时只加入脂质体Lipofectamine 2000。

1.2.3Western-blot检测GRP78蛋白的表达水平提取3组细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔上样50 μg,经电泳、转膜后,以脱脂奶粉室温封闭。加入一抗(β-actin为1∶1 000，GRP78为1∶200)4 ℃孵育过夜，然后使用TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)摇床室温孵育2 h，再用TBST洗膜，最后加入ECL化学发光剂，采用凝胶成像系统进行检测。

1.2.4体外细胞增殖实验 采用CCK-8检测3组细胞的体外增殖能力。取对数生长期的细胞接种到96孔板中，每组设5个复孔，每孔接种4 000个细胞。细胞接种后48 h,每孔加入10 μL的CCK-8，放入37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养2.5 h，酶联免疫检测仪于波长450 nm处测量各孔的吸光度(A)值，实验重复3次，取均值。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1各组细胞GRP78蛋白表达量比较

Western-blot检测的结果显示，以β-actin为参照，实验组、阴性对照组及空白对照组细胞GRP78蛋白的相对表达量分别为0.32±0.15、1.14±0.03、1.03±0.05，实验组细胞GRP78蛋白的相对表达量与另两组比较差异有显著性(F=115.17，q=5.41、15.29，P<0.05)。与阴性对照组比较，实验组细胞GRP78蛋白表达抑制率达70%以上。

2.2GRP78对各组细胞增殖的影响

细胞接种48 h后,空白对照组、阴性对照组、实验组细胞的增殖水平分别为0.78±0.05、0.80±0.03、0.56±0.01,与对照组相比较，实验组细胞的增殖能力明显降低(F=45.60，q=11.16、12.17，P<0.05)。

3 讨 论

GRP78 也称免疫球蛋白重链结合蛋白, 是定位于细胞内质网上的热休克蛋白70家族成员之一[1]。GRP78具有多种生物学功能。作为分子伴侣，GRP78靶向降解错误折叠的蛋白，促进蛋白质的折叠和组装，保持应激状态下细胞内蛋白质的合成[2]；作为Ca2+结合蛋白，维持内质网内Ca2+的平衡；应激情况下，如低氧、酸中毒以及Ca2+内流紊乱等均可导致错误折叠蛋白的聚集，引起GRP78表达升高，以维持内质网功能的稳定[2]。血管化不良引起肿瘤内存在低糖、低氧及酸中毒等应激微环境，从而启动内质网应激，引起GRP78表达，以利于肿瘤细胞的存活[7]。

细胞增殖调控发生严重紊乱会导致肿瘤的发生。JAMORA等[8]研究结果显示，敲除GRP78的纤维肉瘤细胞在动物接种成瘤实验中不能形成肿瘤，证实GRP78为肿瘤生长所需要。DONG等[9]建立GRP78基因杂合子(Grp78+/)小鼠模型，发现尽管杂合子小鼠GRP78的表达明显降低，但并不影响小鼠器官发育及抗体形成。然而体内接种肿瘤细胞以后，GRP78表达下降可明显延长肿瘤发生的潜伏周期，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡，并抑制肿瘤血管生成。GRP78通常定位于内质网内，但在细胞表面也有分布，可将细胞外的信号刺激转为细胞内的信号，从而促进肿瘤的发展。有研究显示，GRP78在1-LN前列腺癌细胞表面高表达，并通过与活化的蛋白激酶抑制剂α2M结合，激活细胞内多种信号转导通路，从而促进肿瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡[10]。

通过免疫组织化学方法，刘芳等[11]研究显示， GRP78在结直肠癌组织中的表达明显高于结直肠正常黏膜、腺瘤，证实GRP78表达升高与结直肠癌的发生相关。王丽丽等[5]通过短发夹状RNA成功抑制结直肠癌细胞系GRP78蛋白的表达，为本实验奠定了基础。本研究通过抑制GRP78在结直肠癌细胞系RKO中的表达，探讨GRP78在结直肠癌细胞增殖过程中所起的作用。结果表明，靶向GRP78蛋白的质粒可以显著下调结直肠癌细胞GRP78蛋白的表达。细胞接种后48 h, GRP78的表达降低可以显著抑制细胞的增殖。

目前研究表明, GRP78在多种肿瘤的侵袭和转移过程中也发挥重要作用。SU等[12]研究显示，在肝癌细胞系中GRP78的过度表达不管在体内和体外都能促进肝癌细胞的侵袭性，这一过程是通过增强黏着斑激酶(FAK)的激活和活性实现的。降低GRP78的表达可以使FAK的磷酸化水平降低，从而使肝细胞癌的侵袭性降低。

在异种移植模型中，抗血管形成因子的使用可以引起GRP78的转录，增加GRP78蛋白的表达[4]。因此，在目前肿瘤治疗基础上，敲除内源性GRP78蛋白的表达，有利于清除残存的肿瘤细胞，为肿瘤的治疗提供新的方向。

总之，在肿瘤的发生发展过程中，GRP78可以发挥上述多重生物学功能。在本研究中，我们通过RNA干扰技术抑制结直肠癌RKO细胞系GRP78蛋白的表达，并通过CCK-8检测干扰前后细胞系的增殖能力，研究结果表明，GRP78表达的降低可以抑制RKO细胞的体外增殖能力。因此，在体外，GRP78可促进结直肠癌的增殖，但具体的机制还有待于进一步研究。

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[11] 刘芳,邢晓明,李玉军,等. 结直肠腺癌组织Grp78表达及意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(3):252-254.

[12] SU R, LI Z, LI H, et al. GRP78 promotes the invasion of he-patocellular carcinoma [J]. BMC Cancer, 2010,10:20.

(本文编辑 厉建强)

THEINFLUENCEOFGRP78ONPROLIFERATIONOFCOLORECTALCARCINOMACELLRKO

LIULili,XINGXiaoming

(Department of Pathology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the influence of GRP78 on proliferation of colorectal carcinoma cell RKO.MethodsPlasmid with targeted GRP78 was transfected into RKO cells by Lipofectamine 2000, Western-blot method was used to detect the expression of GRP78 protein in RKO cells, and cell proliferation ability was measured using CCK-8 assay.ResultsAfter the transfection, the expression of GRP78 protein in RKO cells was significantly declined versus the control group (F=115.17;q=5.41,15.29;P<0.05), and the proliferation of RKO cells significantly decreased as well (F=45.60;q=11.16,12.17;P<0.05).ConclusionGRP78, in vitro, can promote the proliferation of colorectal carcinoma.

glucose regulated protein 78; colorectal neoplasms; cell proliferation

2014-01-18;

2014-03-24

国家自然科学基金资助项目(81201947)；山东省自然科学基金资助项目(ZR2009CM014)

刘丽丽(1988-),女,在读硕士研究生。

邢晓明(1977-),女,博士,副主任医师,硕士生导师。

R735.3

A

1008-0341(2014)03-0199-03