家蝇抗药性的分子机制：乙酰胆碱酯酶介导的抗药性*

邱星辉

(中国科学院动物研究所，农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室， 北京 100101)

突触乙酰胆碱酯酶Acetylcholinesterase(AchE, EC 3.1.1.7) 是生物神经传导行为中的一个重要酶，通过快速水解神经递质乙酰胆碱(acetylcholine, Ach), 终止神经冲动以保持正常的神经信号传导。该酶促水解反应在生物体中非常快速，这也提示该酶活性的降低极有可能带来显著的适合度代价。AChE酶是有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的主要作用靶标，有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂作为不可逆抑制剂通过抑制昆虫乙酰胆碱的活性，降低其对乙酰胆碱的水解活性，使神经递质乙酰胆碱在突触处积累，从而破坏正常的神经传导，最终导致昆虫的死亡。

自上世纪60年代开始，作用于乙酰胆碱酯酶的有机磷类和氨基甲酸酯类化合物被用于许多重要的农业和人畜疾病传媒昆虫(如家蝇)的控制。使用这些类型的杀虫剂之后不久，家蝇抗药性事例不断出现，至今家蝇对常用有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂抗性已是普遍现象，成为家蝇控制工作的一大障碍。以1970年采集后经杀虫威(Tetrachlorvivphos)筛选的Cornell-R品系家蝇为材料获得的生物化学数据首次证明了乙酰胆碱酯对杀虫剂的不敏感性是有机磷抗性的一个重要因素(Tripathietal., 1973)，随后的遗传学、生物化学与分子生物学的研究进一步揭示了乙酰胆碱酯酶介导抗性的分子基础。现就这一领域取得的研究进展从3个方面综合介绍如下。

1 家蝇乙酰胆碱酯酶抗性相关的遗传变异及其进化起源

家蝇基因组发现了单一的乙酰胆碱酯酶基因(mdace)，位于常染色体2上, 编码由692或693个氨基酸残基组成的前体蛋白, 其N-端信号肽序列被切除后形成含612氨基酸残基的成熟蛋白(Kozakietal., 2001；Kimetal., 2003)。本文叙述的氨基酸位点是以AchE成熟蛋白的氨基酸残基编号。

与敏感家蝇相比，从抗性家蝇的mdace基因鉴定出多个不同位点的点突变。Kim 等(2003)发现对有机磷农药敌百虫(Trichlorphon)表现抗性的家蝇的mdace基因编码的蛋白除3个点突变外(I82M、G262A、F327Y), 其蛋白序列的其他氨基酸残基与敏感家蝇相同。Kristensen等(2006)分析了21个田间种群和9个实验室种群，共鉴定出10个氨基酸突变位点(I82M、T180L、T230M、 G262A、 G262V、 F327Y、 G365A、 A583D、 A596T、 L597V),其中7个氨基酸替换(I82M、T180L、 T230M、 G262A、 G262V、 F327Y、 G365A)发生在活性中心或其附近，推测其中V180L、 G262A、 G262V、 F327Y 和 G365A 5个氨基酸替换可导致抗性，而I82M和T230M对抗药性的贡献不大。Kozaki 等(2009) 除发现V180L、 G262A/V、 F327Y突变外，还发现另一抗性相关的氨基酸替换(A236S)。在我国，从2003年上海采集的经残杀威(Propoxur)和灭多威(Methomyl)筛选的抗性品系中鉴定了5个突变(P118S、V180L、 G262A、 F327Y)(Taoetal., 2006)，从2009年广东、上海、山东、北京和吉林5个省市采集的野生家蝇中发现了4个抗性变异点突变(V180L、G262A/V 和F327Y) (Wangetal., 2012)。

生物化学证据显示某些位点的氨基酸残基替换可以导致一定程度的乙酰胆碱酯酶对杀虫剂的不敏感性(Walshetal., 2001)。如乙酰胆碱酯酶G262A突变体对敌敌畏的敏感性下降4.3倍；G262V 突变效应更强，突变体对敌敌畏和bendiocard的敏感性分别下降了58和100倍(Walshetal., 2001)。反过来，262A和327Y分别定点突变为262G和327F可以很大程度地恢复乙酰胆碱酯酶对杀虫剂的敏感性，表明该两个氨基酸残基是决定乙酰胆碱酯酶敏感性的关键位点(Kimetal., 2003)。除这些氨基酸残基外，在乙酰胆碱酯酶的保守序列(FGESAG)中的谷氨酸(E-234)和丙氨酸(A-236)被认为在调节对有机磷的敏感性方面发挥作用(Kimetal., 2003)。对20头家蝇的基因型和AchE活性的抑制相关分析发现，G262A/V 和F327Y与家蝇对杀螟氧磷(Fenitroxon)的不敏感性相关,另外两个点突变 I82M和V180L, 对不敏感性没有明显的效应(Kozakietal., 2001)。A236S变异对不敏感性的效用还不清楚。

氨基酸替换对抗性的贡献与该氨基酸残基的空间位置和大小有关。家蝇乙酰胆碱酯酶180位的氨基酸残基距离催化中心较远，对抗性的贡献不大(Walshetal., 2001)。262位的甘氨酸(G)在不同物种中的乙酰胆碱酯酶中是保守的，在空间结构上与活性位点235的丝氨酸(S-235)距离很近，说明其在维持酶的构象和活性中具有重要的地位(Walshetal., 2001)。甘氨酸的R基团为H, 该氨基酸如突变为丙氨酸(A)或缬氨酸(V)则引入更大的R基团(甲基或异丙基)，会对S-235产生作用力，从而改变酶活性位点的三维结构，继而改变酶的活性。相对于丙氨酸，缬氨酸具有更大且疏水的基团，推测G262V突变的效应比G262A更加强烈，这一推测得到了实验数据的支持(Walshetal., 2001)。365位点的氨基酸与催化三连体的E-364相连，推测对酶活性也将产生影响(Walshetal., 2001)。327位点的氨基酸残基临近乙酰胆碱酯酶与底物结合的乙酰基，乙酰胆碱酯酶抗性突变体327位的R基团为酪氨酸，相比对应的敏感体的苯丙氨酸多了一个羟基，可以降低乙酰胆碱酯酶的酰基-结合袋的空间，从而改变该酶的代谢活性(Walshetal., 2001)。

乙酰胆碱酯酶氨基酸替换可能降低酶的稳定性，且多重替换的效用是累加的(Shietal., 2004)。在所有的研究案例中，多突变组合导致更高水平的抗性，但组合效应并不是每个突变效应的简单叠加(Walshetal., 2001)。单一突变赋予对大多数杀虫剂的抗性，同时也造成对少数杀虫剂的敏感性，突变组合会消除这种负交互抗性，而使昆虫对所有杀虫剂产生抗性，只是抗性程度有所不同(Fournier, 2005)。

系统树分析显示，家蝇AChE抗性相关的氨基酸替换G262A和F327Y有多重的进化起源，V180L、A236S、G262V 进化起源单一，F327Y和G362A是V180L和 A236S的共同的进化前体 (Kozakietal., 2009)。

2 家蝇乙酰胆碱酯酶等位基因的多样性与分布

基因测序分析表明，mdace在大多数品系(或种群)中都包含多个等位基因。多个等位基因并存反映出杀虫剂使用的多重性。Kozaki 等(2009)分析了13个来源于北美、欧洲和亚洲的实验室种群，鉴定出15个不同的等位基因,其中11个为敏感等位基因(编码V180-A236-G262-F327)，4个为不敏感等基因(v10: V180-A236-A232-Y407; v11: V180-S236-A232-Y407; v14: V180-A236-V232-Y407; v15: L180-A236-A232-Y407)。大多数品系为杂合品系，包含2个或2个以上等位基因,但LPR 和 rspin品系为抗性纯合(V180-A236-A262-Y407)。 通过对2002年采集于New York州(53只)和Florida(62只)的野外家蝇的检测，只发现一种不敏感等位基因(v10=Ace1),其他等位基因为敏感等位基因(Aces)，种群中存在3种基因型的个体，即Aces/Aces,Aces/Ace1和Ace1/Ace1(Kozakietal.,2009)，其中大多数个体为杂合基因型(敏感纯合基因型的个体很少)，种群偏离Castle-Hardy-Weinberg平衡，说明杂合子具有适合度方面的优势。

抗性等位基因可能出现生态演替。例如，虽然在2002年野外采集的家蝇中没有发现v10之外的其他抗性等位基因，但v11在1980年从New York州采集、v14在1998年Georgia州采集的家蝇品系中检测到(Kozakietal.,2009)，这可能是因为某些杀虫剂不再使用，从而降低了对v11和v14抗性等位基因的选择压，导致这些等位基因频率下降的缘故。

mdace等位基因的分布因地区而不同，但也有重叠。比如，抗性等位基因v10和v11在美国家蝇中存在，但在来源于欧洲的田间或实验室品系未发现；等位基因v15在一些日本品系中存在，在美国的野生种群中却没有检测到(Kozakietal.,2009)。值得注意的是，在我国5个省市采集的样品中没有一个是敏感纯合基因型个体,其中327Y突变的频率几乎达到100%(Wangetal.,2012)。 我国家蝇呈现6种不同的mdace基因点突变组合，以组合1 (260L-342A-407Y) 和组合5(260V/L-342A/V-407Y)最为普遍(Wangetal.,2012)，其中组合1也见于1991年英国采集的一个品系(77M)中，该品系表现出48倍的对敌敌畏的不敏感性(Walshetal., 2001)。

3 家蝇乙酰胆碱酯酶抗性变异的分子检测方法

家蝇乙酰胆碱酯酶抗性突变在原理上可以通过基因测序的方法，也可以通过其他基因分型的方法来检测。笔者实验室建立了PCR-RFLP方法，可用于快速准确地检测抗药性中起关键作用的262位的基因型(Qiuetal., 2012)。该方法的原理是通过ace基因序列设计引物，PCR扩增出大小约609 bp的产物；再分别用限制性内切酶Bsp1286I 和 Eae I来酶解PCR产物；根据两个酶切反应的酶酶图谱可以很好地区分家蝇个体乙酰胆碱酯酶基因的基因型(Qiuetal., 2012)。

4 结语

抗性家蝇mdace基因的非中性突变(Non-neutral mutations)导致其编码的乙酰胆碱酯酶发生多个位点的氨基酸替换，这些替换单独或联合效应赋予家蝇具有不同的杀虫剂抗性谱(Kozakietal. , 2001)。抗性家蝇种群中乙酰胆碱酯酶普遍存在G262A/V和F327Y突变，表明该两位点上的氨基酸残基在抗性进化过程中起着重要的作用。氨基酸残基G262和F327靠近AchE的活性位点三联体(triad, 即S235-E346-H447), G262A/V点突变被认为可以通过改变起催化作用的丝氨酸的定位，F327Y则通过降低酰基-结合袋的空间来改变酶的活性(Muteroetal., 1994)。家蝇的不同抗性种群具有相同的遗传突变表明该类抗性进化机制的保守性。多种不同抗性等位基因共存于家蝇种群中反映了杀虫剂使用的多重性，也意味着逆转抗性是非常困难的。更深入分析各点突变及突变组合对乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的不敏感性的贡献，加强抗性等位基因频率及其扩散途径的监测具有重要的意义。